Enzimas y Catálisis en Biología y Alimentos

Catalizadores y Enzimas: Fundamentos Bioquímicos

Catalizador: Es una sustancia que acelera una reacción química hasta hacerla instantánea o casi instantánea. Un catalizador acelera la reacción al disminuir la energía de activación.

Enzimas: Son proteínas globulares, algunas de ellas con estructura cuaternaria, capaces de catalizar las reacciones metabólicas. Son muy potentes y eficaces, actúan a temperatura ambiente y consiguen un aumento de la velocidad de reacción de un millón a un trillón de veces. Actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente. Para cumplir su función, requieren conservar su estructura nativa, en la que se destaca una región formada por un número reducido de residuos aminoacídicos que poseen afinidad por los compuestos que intervienen en la reacción. Ese lugar se llama sitio activo, y en él se desarrolla la reacción.

Modelos de Actuación Enzimática

Modelo de Actuación de Enzimas: La enzima (E) se une a la molécula de sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En una segunda etapa, el complejo se fragmenta dando lugar al producto (P) y a la enzima (E), que vuelve a estar disponible para reaccionar con otra molécula de sustrato. La reacción se puede representar como: S + E → ES → P + E.

Modelos de Mecanismo de Reacción de Enzimas:

• Modelo de Fisher «Llave-Cerradura»: La molécula de sustrato se adapta al centro activo de la enzima del mismo modo que lo haría una llave al encajar en una cerradura, es decir, tienen una relación estructural complementaria.
• Modelo de Koshland (Enzima Flexible o Ajuste Inducido): El sitio activo no necesita ser una cavidad rígida y preexistente, sino que dicho sitio activo debe tener una disposición espacial precisa y específica de ciertos grupos de la enzima que, al interaccionar con el sustrato, se adaptan y ajustan a su estructura. Las enzimas, una vez que han realizado la transformación del sustrato (S) en producto, se liberan rápidamente de ellos para permitir el acceso a otros sustratos (S).

Regulación y Regeneración Enzimática

Regulación Enzimática: El metabolismo consiste en una serie de reacciones catalizadas por enzimas, donde los productos de una reacción se convierten en los reactivos de la siguiente, lo que se conoce como vías metabólicas. Las células deben poder regular estas vías metabólicas y lo hacen a través de reguladores enzimáticos, que son inhibidores.

• Inhibición Reversible:
  • Inhibidores Competitivos: Son los que se unen a la enzima ingresando en el sitio activo, impidiendo así su enlace con el sustrato.
  • Inhibidores No Competitivos: Se unen a la enzima en un lugar diferente al sitio activo, cambiando la forma de la proteína y, por lo tanto, la forma del sitio activo. Sus efectos son reversibles.
• Inhibición Irreversible: Hay inhibidores que se unen covalentemente al sitio activo de una enzima. Esta unión es permanente e inactiva a la enzima, destruyendo su capacidad de unirse al sustrato.

Regeneración Enzimática: En la tecnología alimentaria moderna se deben tener presentes los cambios que pueden ocurrir en los procesos tecnológicos. Así, cuando las enzimas se han inactivado, algunas pueden regenerarse, como es el caso de la peroxidasa, la fosfatasa y otras. El método de High Temperature Short Time (HTST) es la aplicación de calor a alta temperatura pero por corto tiempo. Con ello puede suceder que la enzima no se inactive en su totalidad y así recupera parcialmente su estructura nativa después de las 24 horas de elaborado el producto. Con esto, regenera su actividad, en parte, lo suficiente como para que durante el almacenaje resulten efectos dañinos en los alimentos conservados, produciendo mal olor y sabor.

Acción Enzimática en Alimentos: Deterioro y Control

Acción Útil o Deterioro Ejercido por Enzimas en Alimentos: Las enzimas pueden ejercer, según las circunstancias del caso, una acción deseada o no deseada desde el punto de vista de la tecnología de los alimentos.

Las modificaciones causadas por enzimas son:

1. Procesos bioquímicos normales en la vida del alimento:
   • Respiración: Este proceso es importante en hortalizas.
   • Maduración: Importante en frutas.
2. Cambios bioquímicos durante el deterioro:
   • Pardeamiento Enzimático: Formación de olores y sabores indeseables.

Pardeamiento Enzimático: Mecanismo y Control

Pardeamiento Enzimático: Es un conjunto complejo de reacciones que se inicia por la o las reacciones catalizadas de forma enzimática (fenolasa, polifenoloxidasa o polifenolasa). La primera de ellas, cuando el sustrato presente es un monofenol, es su transformación en difenol incoloro. La segunda es la transformación del difenol en quinona. A partir de la formación de la quinona, la reacción progresa de forma espontánea. Las quinonas se pueden convertir en trifenoles y posteriormente oxidarse. Todas estas sustancias son muy reactivas, dando lugar a polímeros y reaccionando con otras sustancias presentes en el alimento. Los productos finales, llamados melaninas, son de color muy oscuro o negro e insolubles en agua. Estos polímeros tienen propiedades antimicrobianas y podrían ser un mecanismo de defensa de los vegetales contra las infecciones. Para que se produzca el pardeamiento es necesario: enzima, sustrato y oxígeno.

Control de la Reacción de Pardeamiento: Se logra evitando el contacto del oxígeno con la superficie de corte, aplicando temperaturas altas o bajas, reduciendo el pH o desnaturalizando la enzima.

Inactivación Enzimática: Métodos

Inactivación de la Enzima Mediante Calor: Tiene la ventaja de que no se aplica aditivo alguno, pero presenta el inconveniente de que la aplicación de calor produce cambios en la textura, dando sabor y aspecto cocido. Para evitar estos inconvenientes, se regula el tiempo de calentamiento, acortándolo justo al mínimo capaz de inactivar la enzima por un escaldado inmediato.

La precocción o Escaldado (Blanching) es el método más conocido y empleado por la industria alimentaria para la inactivación de las enzimas, de modo que las reacciones enzimáticas que inducen los cambios indeseables no ocurran durante las siguientes etapas de los procesos. Este método consiste en exponer durante un tiempo breve la materia prima cruda a altas temperaturas por corto tiempo (3 a 10 minutos como máximo en el caso de las frutas). Se realiza aplicando vapor o por ebullición. La aplicación de vapor tiene la ventaja sobre el agua de que reduce la pérdida de las sustancias solubles en ella, como las vitaminas y sales hidrosolubles.

Inactivación de la Enzima Mediante Inhibidores Químicos:

• Anhídrido Sulfuroso: Es uno de los inhibidores químicos más efectivos y económicos hoy usados en la industria alimentaria, aunque su olor y sabor desagradables pueden comunicarse al alimento cuando se emplea en grandes cantidades.
• Ácidos: Bajo un pH de 2.5, cesa la actividad enzimática, que es óptima entre 5 y 7. Aunque luego se vuelva al pH original de la fruta, la enzima no se recupera, impidiéndose así el pardeamiento.
• Eliminación del Oxígeno: La exclusión del aire al trabajar y envasar rápidamente el material y, en caso necesario, con ayuda del vacío o en atmósfera inerte, representan medidas satisfactorias, especialmente en lo que se refiere a textura y sabor.

Pardeamiento Químico o No Enzimático

Pardeamiento Químico o No Enzimático: Es el resultado de reacciones originadas por las condensaciones entre compuestos carbonilos y aminados, o por la degradación de compuestos con dobles enlaces conjugados a grupos carbonilo. Estas reacciones conducen a la formación de polímeros oscuros que en algunos casos pueden ser deseables (aromas cárnicos sintéticos), pero en la mayoría de los casos conllevan alteraciones organolépticas y pérdidas del valor nutritivo de los alimentos afectados (Actividad de Agua, Aw, entre 0.60 y 0.70). Existen cuatro principales rutas del pardeamiento no enzimático, si bien la química de estas reacciones está relacionada con la reacción de Maillard.

Reacción de Maillard: Es el resultado de productos reductores, primariamente azúcares, que reaccionan con proteínas o con grupos aminos libres. Esta reacción cambia tanto las propiedades químicas como fisiológicas de las proteínas. En general, la acumulación de pigmentos de color marrón indica que la reacción se ha producido en alimentos que contienen hidratos de carbono y proteínas. La reacción depende, además, de la condición ambiental, pH y temperatura.

Microbiología: Fundamentos y Aplicaciones

Microorganismos Relevantes en la Industria Alimentaria

Microbiología: Estudia los microorganismos (MO). Dentro de los MO más importantes en la industria de los alimentos se encuentran: bacterias, levaduras y hongos.

Bacterias: Son organismos unicelulares, en formas de esferas que se denominan cocos o alargados que se denominan bacilos. Tienen un tamaño muy pequeño, solo pueden ser observadas en microscopio.

Levaduras: Son organismos unicelulares. Se diferencian de las bacterias porque las células son más grandes y pueden tener formas variadas (ovales, alargadas, cilíndricas y esféricas). Se reproducen fundamentalmente por gemación. El tamaño de las células es variable; algunas tienen de 5 a 8 micrones y otras pueden llegar a tener otra longitud.

Hongos: Son organismos vegetales que carecen de las raíces, tallos, hojas y clorofila característicos de las plantas superiores. Pueden ser uni o pluricelulares. Los hongos presentes en los alimentos se conocen con el nombre de mohos; son multicelulares, filamentosos, que se distinguen fácilmente en la superficie de los alimentos por su crecimiento algodonoso o aterciopelado.

Factores que Afectan la Actividad Microbiana

Factores que Afectan la Actividad Microbiana:

1. Nutrientes: Como todos los seres vivos, los microorganismos exigen alimentos en calidad y cantidad suficiente para poder desarrollarse. Según las proporciones en que se encuentren estas sustancias nutritivas, se clasifican en macro y micronutrientes.
   • Macronutrientes: Los principales son el carbono (C) y el nitrógeno (N2). El carbono es necesario ya que de él se obtiene la energía para desarrollarse. El nitrógeno lo necesitan para elaborar las distintas enzimas provenientes de la síntesis proteica.
   • Micronutrientes: Estos generalmente están en forma de sales inorgánicas como el sodio, potasio, magnesio (Mg), etc. Son necesarios para el metabolismo celular y generalmente intervienen en la catálisis celular.
2. Humedad: El agua es indispensable para el desarrollo microbiano.
3. pH
4. Temperatura
5. Oxígeno (O2)

Clasificación de los Microorganismos

Clasificación de los Microorganismos:

• Según la fuente de carbono y energía:
  • Autótrofos: Son los que tienen la máxima capacidad de síntesis. Asimilan el carbono y el nitrógeno, obteniendo la energía por un proceso de fotosíntesis.
  • Heterótrofos (Alótrofos): Asimilan carbono orgánico. Requieren de materia orgánica compleja sintetizada por los autótrofos. Dentro de este grupo hay muchos más exigentes.
• Según la temperatura:
  • Psicrófilos: Capaces de crecer a 0°C y su temperatura óptima es 15°C.
  • Mesófilos: Son capaces de crecer entre 25 y 40°C y su temperatura óptima es de 37°C.
  • Termófilos: Su temperatura óptima es entre 45 y 55°C.
• Según el requerimiento de O2:
  • Anaerobios Estrictos: Son aquellos microorganismos que solo pueden crecer en ambientes sin oxígeno.
  • Anaerobios Facultativos: Son aquellos microorganismos que pueden crecer en ambientes con o sin oxígeno, pero la cantidad de oxígeno que toleran son pequeños porcentajes.
  • Aerobios: Son microorganismos que necesitan O2 para desarrollarse. Sin la presencia de este, son incapaces de crecer.

Materiales y Medios de Cultivo en Microbiología

Materiales Utilizados en Microbiología:

• Pipeta Pasteur: Se preparan en el laboratorio empleando tubos de vidrio de 5-10 mm cortados en trozos de 30 cm, a los cuales con la llama de un mechero potente se les realiza un capilar. En el otro extremo sin capilar se coloca un tapón blando de algodón y se esteriliza. Se utiliza para trasladar inóculos líquidos.
• Cajas de Petri: Consisten en dos cristalizadores de tamaño similar, comúnmente de 2 cm de alto por 10 cm de diámetro, de los cuales el más grande se llama tapa y el más pequeño fondo. Se emplean para el cultivo y aislamiento de los microorganismos.
• Asa de Siembra: Están formados por un cabo aislador de baquelita o madera, que se prolonga en un vástago de aluminio que sostiene por medio de una tuerca a presión un alambre de platino o de nicrom dispuesto en forma de anillo, gancho o aguja. Se utilizan para realizar siembras y trasplantes de microorganismos.

Medio de Cultivo: Es un sustrato o solución de nutrientes que constituyen ambientes artificiales, semejantes en lo posible a las condiciones naturales del hábitat donde crecen los microorganismos. Cualquiera sea el medio, debe incluir todo lo necesario para el crecimiento, lo cual variará con el microorganismo que se cultiva. Por lo general, comprende agua, compuestos nitrogenados, fuentes de energía, etc.

Los Medios de Cultivo Pueden Ser:

• Según su origen:
  • Naturales: Son los provenientes de organismos vivos y que solo sufren las alteraciones inherentes a su preparación. Se caracterizan porque no se conoce con exactitud su composición química. Pueden ser de origen animal (ej. leche) o vegetal (ej. papa).
  • Artificiales: Son preparados en base a fórmulas en las cuales entran diversas sustancias de composición química conocida. La ventaja de estos medios es que cualquier investigador los puede reproducir sin dificultad.
• Según su estado físico:
  • Líquidos: Como su nombre lo indica, se presentan en estado líquido y se utilizan generalmente para acelerar el desarrollo microbiano. Presentan el inconveniente de que no permiten la obtención de cultivos puros, al no formarse colonias.
  • Sólidos: Son aquellos que han sido solidificados por el agregado de distintas sustancias (agar, gelatina), lo cual facilita la obtención de cultivos puros. Ello se debe a que los microorganismos quedan fijados al medio sólido de tal manera que un microorganismo fijo puede multiplicarse formando una colonia que luego puede ser aislada, obteniéndose así un cultivo puro.

Esterilización: Es la práctica por la cual todo ser vivo, ya sea en forma vegetativa o esporulada, es destruido.

Técnicas de Siembra y Observación Microscópica

Siembra de Microorganismos

Siembra: Sembrar un microorganismo es colocarlo en uno de los ambientes adecuados, elegido según las exigencias vitales del mismo, permitiendo así su desarrollo y multiplicación, si se lo coloca a una temperatura adecuada y un tiempo conveniente. Dos pueden ser las finalidades de la siembra en un medio de cultivo:

1. Trasplante: El material que se siembra contiene una sola especie microbiana y su objeto es renovar el medio de cultivo, ya sea para perpetuar la especie de que se trate o bien para conocer algunas de sus propiedades. Se renueva el medio de cultivo porque los microorganismos, con su desarrollo, van empobreciendo el medio de nutrientes y además se van acumulando los productos de desecho, como toxinas.
2. Aislamiento: El material que se siembra contiene mezclas de especies bacterianas y su objetivo es separarlas, obteniendo posteriormente cultivos puros.

Técnicas de Siembra Específicas

• En Tubos de Ensayo con Medios de Cultivo Líquidos (Muestra líquida o sólida): No olvidarse del ambiente de asepsia. Se toma la muestra, ya sea con pipeta esterilizada previamente o asa esterilizada en la llama del mechero, y se vuelca en el tubo que contiene el medio de cultivo estéril. Luego, al colocar el tapón al tubo, se esteriliza el asa en la llama del mechero o bien se coloca el capuchón a la pipeta en caso de usar esta, y se mezcla el material sembrado haciendo girar el tubo entre las manos.
• En Tubos de Ensayo con Medio Sólido por Estrías (Muestra sólida o líquida): Se utilizan tubos conteniendo cualquier medio sólido con la superficie inclinada. Se toma la muestra con el asa en anillo, se introduce en el tubo con el medio solidificado y se siembra con movimientos en zigzag desde el fondo del tubo, avanzando hacia arriba en toda la superficie del medio.
• En Tubos de Ensayo de Medio Sólido a Medio Sólido por Picadura (Muestra líquida): La toma del material se hace con un asa en aguja. El tubo en que se va a realizar la siembra contiene el medio en forma recta. La siembra se realiza introduciendo el asa en el seno del medio por punción. Se retira el asa por el mismo recorrido de entrada y se tapa el tubo. El desarrollo se realiza en la línea de siembra.
• En Caja de Petri con Medio Sólido en Superficie por Estría (Muestra líquida o sólida): Se toma la muestra con el asa en anillo y se realiza la siembra haciendo pasar el asa en zigzag sobre la superficie del medio.
• En Caja de Petri con Medio Sólido por Agar Volcado (Muestra líquida o sólida): Se coloca 1 ml de la muestra en la caja de Petri estéril y se vuelca en el medio fundido y tibio. Luego se mezcla con movimientos lentos y se deja solidificar.

Métodos de Observación Microscópica

Métodos de Observación Microscópica:

1. Directa (en fresco): Si el microorganismo está en medio líquido, se deposita una gota del mismo en el portaobjetos. Se coloca encima un cubreobjetos, cuidando que no queden burbujas de aire, y se observa. Se enfoca con el objetivo de menor tamaño y se va aumentando a medida que se desee observar con mayor detalle. Cuando están formadas las colonias en medio sólido, se coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos y en ella se suspende una pequeña cantidad de cultivo hasta formar una suspensión lechosa. Se coloca el cubreobjetos y se observa.
2. Observación con Coloración: Se emplea con dos fines: para facilitar la observación microscópica y para poner en evidencia ciertas estructuras intra y extracelulares.

Técnica de Coloración

Cuando los microorganismos se observan en preparados coloreados, se exigen los siguientes pasos:

1. Extensión del material: Sobre el centro del portaobjetos se coloca una gota del material si es líquido, o si se trata de un cultivo sólido, se debe colocar una gota de agua y diluir la muestra en esta con el asa en anillo.
2. Secado y Fijación: Se seca sobre la llama del mechero a unos 20 o 30 cm de distancia. Se efectúa con el objeto de que los microorganismos queden adheridos en el portaobjetos y no se arrastren con el lavado. Este se realiza pasando 3 veces el preparado por la llama.
3. Coloración: Se hace actuar el colorante sobre la preparación ya fijada.

Tipos de Tinción

Tinción Simple: En la coloración se utilizan los colorantes fucsina o azul de metileno. La solución de colorante se agrega sobre la preparación fijada y se deja actuar durante 1 o 2 minutos. Luego se lava con agua para sacar el exceso de colorante, se seca con cuidado primero con papel por los bordes y luego sobre la llama, y se observa con objetivo de inmersión usando aceite de inmersión o vaselina líquida como medio.

Tinción de Gram: Pasos:

1. Preparar frotis sobre un portaobjetos.
2. Teñir con solución de cristal violeta (1 minuto).
3. Lavar con agua.
4. Poner Lugol (1 minuto).
5. Lavar con alcohol 95% (30 segundos).
6. Lavar con agua.
7. Colocar safranina.
8. Lavar con agua.
9. Secar al aire.
10. Observar si son Gram positivos o negativos.