Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR (Polymerase Chain Reaction) es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde. Sus principales aplicaciones incluyen:

• Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción (PCR múltiple).
• Amplificar fragmentos de ARN (RT-PCR o PCR con transcriptasa inversa).
• Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en una muestra (PCR cuantitativa o PCR a tiempo real).

Bases Teóricas de la PCR

La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa, basado en la replicación del ADN. En cada ciclo de replicación se obtienen nuevas copias de ADN. Este diseño repetitivo es la clave de la amplificación, puesto que las copias nuevas obtenidas en cada ciclo sirven también de molde para sintetizar otras nuevas copias en los ciclos siguientes, produciendo un aumento exponencial en el número de copias a cada ciclo de replicación sucesivo que se realice.

Desafíos y Soluciones en la PCR

La implementación exitosa de la PCR requirió resolver dos problemas fundamentales:

1. ¿Cómo conseguir que en cada ciclo de la técnica únicamente se copie (se replique) el fragmento que nos interesa, entre una mezcla compleja de moléculas de ADN?
2. ¿Cómo conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la temperatura elevada que es necesaria en la fase de desnaturalización del ADN molde?

La solución al primer problema fue el diseño de cebadores específicos (primers) que permiten la amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN, mientras que la solución al segundo problema fue el descubrimiento de las ADN polimerasas termoestables (como la Taq polimerasa).

Mezcla de Reacción de la PCR

La mezcla de reacción contiene todos los componentes necesarios para realizar una PCR:

• Cebadores (primers)
• Taq polimerasa (o cualquier otra ADN polimerasa termoestable)
• Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs)
• ADN molde
• MgCl₂ (iones de magnesio). Las ADN polimerasas termoestables requieren iones de magnesio (Mg²⁺) como cofactor para desarrollar su actividad.
• Solución tampón o buffer

Los Cebadores o Primers

Los cebadores son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria a regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar. Se diseñan siempre por parejas y cada uno es complementario a una secuencia adyacente a la región de interés, pero en extremos y cadenas opuestas. La actividad enzimática de la ADN polimerasa se da sobre una molécula monocatenaria de ADN (que se ha desnaturalizado previamente). Los cebadores delimitan la región de la molécula de ADN que se amplificará.

• El cebador que se va a unir a la hebra molde conductora (dirección 5’ a 3’) se denomina cebador R.
• El cebador que se va a unir a la hebra molde (dirección 3’ a 5’) se denomina cebador F.

Existen programas bioinformáticos que permiten diseñar cebadores específicos a partir de la secuencia que se quiere amplificar.

Requisitos para el Diseño de Cebadores

El diseño de los cebadores debe cumplir una serie de requisitos:

a) Secuencia

Los cebadores no deben contener secuencias complementarias intra- o intermoleculares. La presencia de secuencias complementarias intramoleculares puede dar lugar a la formación de estructuras secundarias (como horquillas) que impidan su unión al ADN molde. También hay que evitar que se unan consigo mismos y formen un autodímero. La presencia de secuencias complementarias intermoleculares entre ambos cebadores puede ocasionar la dimerización de estos (primer dimer), disminuyendo su concentración efectiva.

b) Temperatura de Fusión (Tm)

La Tm de los cebadores debería estar en el rango de 60-70 ºC, aunque no siempre es posible.

c) Longitud

El tamaño ideal es de entre 20 y 30 bases. Por encima o por debajo de esas cifras pueden ocurrir defectos en la amplificación o que estos no se unan correctamente.

d) Composición de Bases

El contenido de G+C debe estar comprendido entre el 30% y el 40%.

ADN Polimerasas Termoestables

Para que la ADN polimerasa pueda sintetizar cadenas nuevas de ADN, es necesario que el ADN molde sea monocatenario. Esto obliga a que cada ciclo de la PCR comience por una fase de desnaturalización por calor, lo que inactiva las ADN polimerasas convencionales (termolábiles).

Las ADN polimerasas termoestables son enzimas aisladas de bacterias o arqueas extremófilas (termófilas), con actividad polimerasa a temperaturas elevadas. Estas enzimas tienen su temperatura óptima entre 70-75 ºC (máxima actividad a 72 °C). Esto permite hibridar los cebadores al ADN molde a temperaturas relativamente elevadas, fijando unas condiciones de alta rigurosidad, lo cual maximiza la especificidad de la reacción.

Tienen capacidad de mantener su actividad polimerasa tras tiempos prolongados de incubación a 95 ºC (aproximadamente 40 minutos), lo que garantiza que la enzima no se inactivará durante las fases de desnaturalización del ADN.

La ADN polimerasa más utilizada en la PCR es la Taq polimerasa, aislada de la bacteria Thermus aquaticus. Al igual que las ADN polimerasas bacterianas convencionales, estas enzimas catalizan la incorporación de nucleótidos en dirección 5’ a 3’, utilizando como molde un ADN monocatenario y en presencia de iones magnesio (Mg²⁺).

Ciclo Básico de la PCR

El resultado final de cada ciclo es la síntesis de una molécula de ADN nueva por cada fragmento de ADN molde presente en la mezcla de reacción. Esta molécula de ADN nueva servirá también de molde en el siguiente ciclo. El ciclo consta de tres fases:

1. Desnaturalización del ADN molde.
2. Hibridación de los cebadores con el ADN molde (Anillamiento).
3. Extensión de los cebadores.

Fase I. Desnaturalización

Esta fase se suele realizar a 94-96 ºC durante 15-30 segundos. Es crucial asegurar que se desnaturalice la molécula completa de ADN molde, pero sin exceder el límite de tiempo que podría inactivar la Taq polimerasa.

Fase II. Hibridación (Anillamiento)

La hibridación de los cebadores con el ADN molde se realiza habitualmente a una temperatura de entre 50 ºC y 65 ºC. El valor concreto depende de la Tm de los cebadores y suele estar comprendido en el rango Tm ± 5 ºC. La temperatura óptima de hibridación debe fijarse de forma experimental para cada pareja de cebadores. El tiempo estándar oscila entre 30 y 60 segundos.

Fase III. Extensión (Elongación)

Se realiza a la temperatura óptima de polimerización de la enzima empleada, que en el caso de la Taq polimerasa es de 72 ºC. La temperatura de elongación debe ser superior a la temperatura de anillamiento de los cebadores para evitar que hibriden de un modo inespecífico.

El tiempo de la fase de extensión está condicionado por la velocidad de polimerización de la enzima y la longitud del fragmento que se va a amplificar. La Taq polimerasa tiene una velocidad de polimerización de alrededor de 60 nucleótidos/segundo. Para esta enzima, se recomiendan tiempos de extensión de 20 segundos para fragmentos de 500 pb. Para enzimas con actividad correctora, se requieren tiempos de extensión más prolongados (aproximadamente dos minutos para fragmentos de 1 kb).

Productos de Amplificación de la PCR

Tras un número de repeticiones del ciclo básico de PCR se obtienen varios tipos de productos de amplificación, unos deseados y otros no deseados. El producto de ADN que tiene exactamente la secuencia y el tamaño que queremos amplificar se denomina amplicón. En cada ciclo, el número de productos no deseados aumenta aritméticamente, mientras que el número de amplicones aumenta exponencialmente, de manera que lo que se obtiene son principalmente amplicones.

Tipos de PCR

1. PCR Estándar: Es la forma más simple de PCR, en la que se amplifica un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de amplificación a tiempo final.
2. PCR Anidada (Nested-PCR): Consiste en la realización de dos reacciones PCR acopladas, donde la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la primera. Se usa para aumentar la sensibilidad (cuando el rendimiento es bajo) o para aumentar la especificidad (cuando hay acúmulo de productos no deseados).
3. PCR Múltiple (Multiplex PCR): Consiste en la amplificación de varias secuencias diana simultáneamente, en el mismo tubo, empleando varias parejas de cebadores en una sola reacción.
4. PCR con Transcriptasa Inversa (RT-PCR): Permite amplificar y analizar moléculas de ARNm.
5. PCR a Tiempo Real (qPCR): La PCR estándar y sus variantes se consideran reacciones a punto final. En la PCR a tiempo real, en cambio, se puede observar el proceso de amplificación usando reactivos fluorescentes (Ej. SYBR Green) que se intercalan en el ADN, permitiendo detectar los amplicones ciclo a ciclo.

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Hibridación de Ácidos Nucleicos

La hibridación de ácidos nucleicos consiste en la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos, por la complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria. Las dos cadenas complementarias que se unen proceden de moléculas diferentes y pueden ser:

• Dos cadenas de ADN.
• Dos cadenas de ARN.
• Una cadena de ADN y una de ARN.

Las técnicas de hibridación se utilizan para detectar secuencias concretas de bases nitrogenadas en la muestra problema de ácido nucleico. Para ello se emplean cadenas de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la secuencia diana (Sondas), las cuales se marcan para poder ser visualizadas. Lo que se obtiene es una molécula bicatenaria híbrida (target + sonda) que podrá ser visualizada gracias al marcaje de la sonda.

Bases Teóricas de la Hibridación

El proceso de hibridación sonda/secuencia diana se basa en los fenómenos de desnaturalización y renaturalización de las moléculas bicatenarias del ADN.

a) Desnaturalización

Es una propiedad del ADN consistente en la separación de las dos cadenas de una molécula bicatenaria por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias. La desnaturalización se consigue aumentando la temperatura o aumentando el pH (pH alcalino). Su comportamiento se representa en la curva de fusión del ADN.

Curva de Fusión del ADN

Si se mide la absorbancia a 260 nm de una solución de una molécula bicatenaria de ADN en función de la temperatura, se obtiene una curva de tipo sigmoide, llamada curva de fusión.

Temperatura de Fusión (Tm)

Se define la temperatura de fusión (Tm) de una molécula bicatenaria de ADN como la temperatura a la cual la desnaturalización es del 50%. Esta depende de:

• Longitud: En moléculas de menos de 500 pb, la Tm aumenta con la longitud.
• Proporción G/C: En moléculas de más de 500 pb, el factor que más influye es el contenido en GC. Cuanto mayor es el contenido de G/C, mayor es la Tm, puesto que hay que romper más puentes de hidrógeno.

b) Renaturalización

La renaturalización es el proceso por el cual las dos cadenas de una molécula de ADN completamente separadas mediante desnaturalización térmica vuelven a reasociarse al bajar lentamente la temperatura, hasta formar la doble hélice original.

c) Hibridación

El híbrido sonda/secuencia diana tiene las mismas propiedades que una molécula bicatenaria de ADN en cuanto a desnaturalización y renaturalización. Las sondas usadas en las técnicas de hibridación suelen reconocer regiones de ADN o ARN de secuencia única.

Factores que Influyen en la Hibridación

1. Fuerza Iónica de la Solución: Los ácidos nucleicos (AN) y los híbridos tienen carga eléctrica neta negativa debido a los grupos fosfatos. Los cationes presentes en la solución rodean los híbridos neutralizando la carga negativa. Este fenómeno estabiliza la doble hélice porque disminuye la repulsión entre las dos cadenas. Cuanto mayor es la concentración de cationes, más calor deberá aplicarse para desnaturalizar.
2. Agentes Desnaturalizantes y Solventes Orgánicos: Compuestos como el dimetilsulfóxido (DMSO) o la formamida desestabilizan los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias, facilitando la ruptura. Si se añaden a la solución, se requiere menos energía para desnaturalizar el híbrido.
3. Porcentaje de Bases No Complementarias (Mismatch): Una sonda puede unirse tanto a su secuencia diana como a secuencias parecidas que tienen bases no complementarias. Se pueden formar híbridos imperfectos que mantienen un número reducido de bases desapareadas y, por tanto, tienen menor número de puentes de hidrógeno que los perfectos. A mayor mismatch, menor temperatura de fusión (Tm).

Tipos y Características de las Sondas

3.1 Características Generales

Las sondas pueden ser bicatenarias o monocatenarias y su tamaño puede oscilar entre el de pequeños oligonucleótidos y el de grandes moléculas de miles de nucleótidos. La elección dependerá de la especificidad y sensibilidad que se pretenda conseguir.

• Especificidad: Capacidad que tiene una sonda para discriminar la secuencia diana con la que se tiene que hibridar. El tamaño mínimo de la secuencia de una sonda para que sea específica debe ser de 16 bases. Las secuencias inferiores a 16 bases tienen una probabilidad muy elevada de encontrarse repetidas aleatoriamente en el genoma.
• Sensibilidad: Probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-diana. Está en relación con el número de moléculas marcadoras que admite la sonda.

3.2 Sondas de ADN

Las sondas de ADN son las más utilizadas por su facilidad de obtención y versatilidad. Según el proceso de obtención, pueden ser:

• De Síntesis Química: Son monocatenarias y pequeñas (<200 nucleótidos), siendo las más habituales inferiores a 40-50 nucleótidos. Su tamaño reducido les permite una mejor penetración en el tejido, ventajoso en las técnicas de hibridación in situ.
• De ADN Recombinante: Se obtienen por un proceso de clonación y amplificación por cultivo. Son bicatenarias, por lo que necesitan desnaturalización por calor como paso previo. Tienen mayor especificidad al ser de gran tamaño.
• De PCR: Se obtienen amplificando el fragmento de interés mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Son bicatenarias.

3.3 Sondas de ARN (Ribosondas)

Son menos utilizadas que las sondas de ADN. Son siempre monocatenarias, por lo que no requieren un paso previo de desnaturalización antes de la hibridación.

• Ventaja: Los híbridos ADN/ARN son ligeramente más estables que los híbridos ADN/ADN.
• Inconveniente: Son muy sensibles a la contaminación dada la omnipresencia de las ARNasas, que las degradan rápidamente.

3.4 Sondas Químicas Sintéticas de Ácidos Nucleicos

Son sondas con modificaciones químicas sintéticas, como las sondas de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o sondas de ácidos nucleicos bloqueados.

Marcaje de las Sondas

Las sondas empleadas en técnicas de hibridación deben estar marcadas para poder detectar el híbrido formado con la secuencia diana. La mayoría de los procesos de marcaje utilizan reacciones enzimáticas y se basan en la incorporación a la sonda de nucleótidos marcados.

Tipos de Marcadores

El tipo de marcador utilizado condiciona el método de detección del híbrido. Se clasifican según permitan o no la detección directa:

Marcadores que posibilitan la Detección Directa del Híbrido

a) Isótopos Radiactivos

Son elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones. Los más utilizados son el fósforo-32 (³²P) y el tritio (³H). El marcaje se produce introduciendo nucleótidos radiactivos.

• Ventajas: Gran sensibilidad.
• Inconvenientes: Requieren instalaciones e infraestructuras adecuadas y personal entrenado.
• Técnicas: Southern blot, Northern blot y Dot blot. La detección se realiza mediante autorradiografía con una película de rayos X.

b) Fluorocromos

Son compuestos químicos que emiten fluorescencia al ser excitados por luz UV. Ejemplos incluyen las cianinas (Cy3, Cy5, Cy7) o el FITC (isotiocianato de fluoresceína). Las sondas marcadas con fluorocromos se utilizan principalmente en la técnica FISH (Hibridación in situ Fluorescente). El empleo de varios fluorocromos permite detectar simultáneamente varias secuencias diana. Se requiere un microscopio de fluorescencia para la detección.

Marcadores que requieren Métodos Indirectos de Revelado

a) Haptenos

Los haptenos son moléculas de pequeño tamaño que se acoplan a los nucleótidos y no alteran la especificidad de la sonda. No pueden ser detectados directamente, por lo que la detección del híbrido requiere métodos indirectos:

• Inmunohistoquímicos: Con un anticuerpo antihapteno marcado con un fluorocromo (visualización con microscopio de fluorescencia).
• Enzimático: Con un anticuerpo marcado con una enzima que cataliza una reacción en la que se produce un producto coloreado (visualización con microscopio óptico convencional).

Los haptenos más utilizados son la digoxigenina y la biotina. Las enzimas más empleadas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.

Fases del Proceso de Hibridación

a) Fase de Prehibridación

Es la fase de preparación de la muestra y el soporte. Según la técnica, puede incluir múltiples pasos como digestiones enzimáticas, electroforesis, transferencias, bloqueos de uniones inespecíficas, etc.

b) Fase de Hibridación

En esta fase se produce la formación del híbrido sonda/secuencia diana. La mayor eficiencia de hibridación se consigue a temperaturas comprendidas entre Tm–32 ºC y Tm–16 ºC, siendo máxima a Tm–25 ºC. El tiempo de incubación de la sonda depende de su concentración (entre 30 minutos y 24 horas).

c) Lavado de Poshibridación

Esta es una fase crítica. El objetivo es mantener los híbridos sonda/secuencia diana y eliminar los híbridos imperfectos con secuencias parecidas a la diana. De esta fase depende en gran medida la especificidad de la técnica. El lavado se realiza con un tampón en el que se fijan las llamadas condiciones de rigurosidad (stringency), combinando temperatura de lavado, pH, fuerza iónica y concentración de formamida.

d) Fase de Detección del Híbrido

Consiste en detectar los híbridos específicos gracias al marcaje de la sonda:

• Marcaje Radiactivo: Tras el revelado de la placa de rayos X, la positividad se observa como marcas oscuras (puntos, manchas o bandas).
• Fluorocromos: Las preparaciones se llevan al microscopio de fluorescencia, donde la excitación con una longitud de onda adecuada produce la emisión fluorescente del marcador.
• Haptenos: La detección se realiza por métodos inmunohistoquímicos con un anticuerpo antihapteno marcado con un fluorocromo o una enzima.

Técnicas de Detección Específicas

• Hibridación in situ Fluorescente (FISH): Las sondas se marcan con fluorocromos. Se requiere un microscopio de fluorescencia.
• Hibridación in situ Cromogénica (CISH): Las sondas se marcan con haptenos. Los híbridos se detectan por métodos inmunohistoquímicos, produciéndose una reacción coloreada que se visualiza con un microscopio óptico normal.

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Clave de Respuestas

A continuación, se presenta la clave de respuestas correspondiente al Tema 2:

• 1: A
• 2: D
• 3: C
• 4: C
• 5: D
• 6: B
• 7: D
• 8: C
• 9: B
• 10: A
• 11: D
• 12: A
• 13: D
• 14: A
• 15: B
• 16: A
• 17: D
• 18: D
• 19: C
• 20: C