PRÁCTICA 6. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

Conocimientos previos:

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE). La separación electroforética depende de la densidad de carga de las moléculas y de su tamaño, por lo que dos proteínas con idéntica densidad de carga, pero de tamaño diferente pueden ser separadas, ya que el soporte dificulta más el avance de la de mayor tamaño.

Son químicamente inertes frente a las moléculas biológicas, transparentes y estables en un amplio intervalo de valores de pH, temperatura y fuerza iónica.

Son también resistentes a agentes desnaturalizantes (urea, detergentes), no presentan efecto EEO (electroendósmosis) y son mecánicamente estables, por lo que pueden ser deshidratados y reducidos a una fina película, lo que facilita su almacenamiento.

Fundamento: El principio de la electroforesis se basa en el diferente comportamiento que presentan las moléculas cargadas frente a un campo eléctrico general. La electroforesis en proteínas nos permite analizar el grado de pureza, sus pesos moleculares y, en algunos casos, su estructura cuaternaria.

El uso de agentes desnaturalizantes y reductores es importante para este proceso.

d. Instrumentos:

Tubo: Consiste en un tubo de vidrio de dimensiones variables, aunque normalmente es de 15-20 cm de largo × 0.5-0.8 cm de diámetro interno, abierto por los extremos.

Se tapa el orificio inferior y se rellena con la disolución de polimerización sobre la que se deposita una pequeña cantidad de butanol (con esto se evita que al polimerizar el gel forme menisco y se excluye el oxígeno que interfiere en la polimerización).

Placa: Es la forma más habitual en la que se desarrolla la PAGE. Puede llevarse a cabo en posición horizontal o vertical, aunque lo más habitual (sobre todo para la separación de proteínas) es en vertical.

Preparación del soporte: El soporte se prepara a partir del monómero de acrilamida que forma largas cadenas lineales, con abundantes grupos polares que las hacen solubles en medios acuosos.

En función de la concentración de acrilamida se obtienen entramados más o menos densos, mientras que la cantidad de bisacrilamida condiciona el grado de entrecruzamiento de las cadenas.

Ambos componentes determinan, en conjunto, las características físicas del gel resultante: su resistencia mecánica, fragilidad, elasticidad, grado de reticulación (tamaño de poro), etc.

Polimerización de la Acrilamida: Se obtiene por la adición de catalizadores de la polimerización que inician y aceleran el proceso de formación de un gel tridimensional. El proceso se inicia con la adición de persulfato amónico a una disolución acuosa (tampón) de ambos monómeros (acrilamida + bisacrilamida), seguido de la adición de TEMED (N,N,N’,N’-tetrametilendiamina) que actúa como propagador de la reacción de polimerización a pH básico (el pH ácido retarda la polimerización).

Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. El buffer será la sustancia que dé la carga a la proteína dependiendo del PI.

PRÁCTICA 7. CROMATOGRAFÍA DE PROTEÍNAS

Conocimientos previos: griego chromos = color.

Cromatografía es el término usado para una familia de técnicas de laboratorio para la separación de mezclas. Esta involucra el pasar una mezcla de compuestos a través de una fase estacionaria, la cual permite que sean separadas de acuerdo a sus propiedades.

La cromatografía es un método de separación físico para separar.

PROCESO.

En toda cromatografía existe un contacto entre dos fases:

1. Fase estacionaria: fija.

1. Alúmina.
2. Sílice.
3. Resinas de intercambio iónico: son matrices sólidas que contienen sitios activos (también llamados grupos ionogénicos) con carga electrostática (positiva o negativa).

2. Fase móvil: fluye permanentemente durante el análisis, y que en este caso es un líquido o mezcla de varios líquidos.

Acuoso: Solución amortiguadora. Orgánicos: ACN, MeOH, Isopropanol, etc.

Tipos: Isocrática, gradiente.

Principio: La muestra queda retenida sobre el soporte sólido por afinidad electrostática. Dependiendo de la relación carga/tamaño, unos constituyentes de la mezcla serán retenidos con mayor fuerza sobre el soporte sólido que otros, lo que provocará su separación.

Las sustancias que permanecen más tiempo libres en la fase móvil avanzan más rápidamente con el fluir de la misma y las que quedan más unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y, por tanto, tardarán más en salir o fluir.

ESQUEMA DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC – COMPONENTES).

Cromatograma: Es la representación gráfica de la señal en función del tiempo una vez que la muestra es inyectada a un sistema cromatográfico. Para obtener este cromatograma a la salida de la columna se coloca un sistema de detección y registro, que permite responder a una propiedad de la solución que contiene el analito o del propio analito en función del tiempo.

DEFINICIONES.

Tiempo de Retención: El tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra para que el pico del analito alcance el detector se denomina tiempo de retención y se le da el símbolo tR.

Tiempo Muerto: Es el tiempo tM para que la especie no retenida alcance el detector.

Constante de Distribución: Los equilibrios de distribución implicados en cromatografía suponen la transferencia de un analito entre las fases estacionaria y móvil.

Factor de Capacidad: Es un parámetro (k’) que se utiliza para describir las velocidades de migración de los analitos en las columnas y se interpreta considerando que mientras mayor sea el valor de este factor, menor es la velocidad de migración de los solutos en la columna.

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS.

Para poder separar y purificar proteínas y péptidos es necesario estudiar el carácter de las sustancias y seleccionar un modo de separación.

Para poder escoger el modo de separación se debe considerar cuál de los siguientes casos describe mejor a tu analito.

• El caso en el que la diferencia en pesos moleculares es grande:

Cromatografía de exclusión molecular.

• El caso en el que existan diferencias en el punto isoeléctrico: cromatografía de intercambio iónico.
• El caso en que existen diferencias en la hidrofobicidad: cromatografía de fase reversa.
• El caso en que exista una afinidad a un tipo de resina:

Cromatografía de afinidad.

• En todos los casos hay que considerar factores como el pH, termoestabilidad y concentración.