Endosporas: Métodos de Detección y Recuento

1. Tratamiento Térmico y Siembra por Vertido en Placa

• Resuspender 11 g de muestra en una botella con 99 mL de solución salina fisiológica (SSF). Esta será una dilución 1/10, también referida como dilución 10⁻¹.
• Homogeneizar durante 3 minutos y calentar a 80 °C durante 15 minutos. Este calentamiento se realiza para eliminar las bacterias heterótrofas mesófilas, constituyendo el tratamiento térmico.
• De la dilución 10⁻¹, tomar 1 mL para realizar un banco de diluciones seriadas (de 10⁻² a 10⁻⁵) en tubos con 9 mL de SSF.
• Añadir 1 mL de cada dilución en su placa correspondiente.
• Verter sobre cada placa un tubo de 20 mL de PCA fundido (a 50 °C), homogeneizar y dejar solidificar.
• Homogeneización de la placa: Realizar 5 movimientos de arriba abajo, 5 círculos en sentido horario, 5 movimientos de abajo a arriba y 5 círculos en sentido antihorario.
• Incubar a 30 °C durante 48 horas.

2. Observación de Placas y Descripción de Colonias

Si hay crecimiento, se observan colonias tanto en la superficie como en el fondo de la placa (crecimiento tridimensional).

3. Siembra de Colonias Seleccionadas en TSA y Agar Esporulación para Aislamiento

• En dos placas de cultivo (TSA y Agar Esporulación), dividir cada una en dos secciones para sembrar las colonias observadas (utilizando el método de siembra por agotamiento).
• El Agar Tripticasa Soja (TSA) es un medio nutritivo general para el crecimiento y aislamiento de una gran variedad de bacterias. Incubar a 30 °C durante 24 horas.
• El Agar Esporulación se incuba a 30 °C durante 3 días.

4. Recuento Presuntivo de Endosporas

Realizar el recuento en las placas que presenten entre 25 y 250 colonias. El resultado se expresa en UFC/g (Unidades Formadoras de Colonias por gramo).

5. Placas TSA: Tinción de Gram (Método KOH)

• Tomar de la placa TSA una colonia de cada cepa y colocarla en un portaobjetos.
• Añadir una gota de KOH sobre cada colonia y remover con un asa de siembra de bucle.
• Resultados:
  • Si hay viscosidad (filancia): Gram negativo (-)
  • Si no hay viscosidad: Gram positivo (+)

6. Tinción de Endosporas a partir de Agar Esporulación

Si las colonias son Gram positivas, se realiza una tinción de esporas según el método de Schaeffer-Fulton para cada una de las cepas de las placas sembradas. Las endosporas aparecen teñidas de color verde y la célula vegetativa de color rojo. Se utilizan verde malaquita y safranina.

Detección y Caracterización de Pseudomonas

1. Siembra en Caldo Asparagina (Método NMP) y Lectura

• El método del Número Más Probable (NMP) indica la presencia o ausencia de determinados microorganismos en muestras diluidas de alimentos o bebidas. En este caso, se utiliza una muestra de agua para detectar la posible presencia de P. aeruginosa.
• Inocular 9 tubos de Caldo de Asparagina: 3 tubos con 10 mL de muestra, 3 tubos con 1 mL de muestra y 3 tubos con 0,1 mL de muestra.
• El Caldo de Asparagina contiene glicerol como única fuente de carbono y asparagina como única fuente de nitrógeno.
• Incubar a 35 °C durante 24-48 horas.
• Un resultado es positivo si se observa fluorescencia bajo luz UV (el tubo presenta turbidez con un pigmento verdoso fluorescente visible sin luz UV). La mayoría de las cepas de P. aeruginosa producen los pigmentos piocianina (pigmento azul-verdoso) y pioverdina o fluoresceína (pigmento amarillo-verdoso). La fluorescencia se debe a la producción de pioverdina.

2. Siembra en Caldo Acetamida y Agar Cetrimida (Prueba Confirmativa)

Se procede a la prueba confirmativa para los tubos positivos (verdadero positivo).

• Los tubos positivos se siembran en Caldo Acetamida (100 µL). Incubar a 35 °C durante 24 horas. El Caldo Acetamida tiene acetamida como única fuente de carbono.
• Aparte, los tubos positivos se siembran en placas con Agar Cetrimida. Tomar un inóculo con un asa de siembra en bucle (siembra por agotamiento). Incubar a 35 °C durante 48 horas.
• El Agar Cetrimida contiene cetrimida como inhibidor selectivo; el MgCl₂ y K₂SO₄ incrementan la producción de piocianina y fluoresceína. Es menos selectivo que el medio CN, pero a efectos prácticos son prácticamente iguales.

3. Lectura y Determinación del NMP/100 mL

• Añadir 1-2 gotas de reactivo de Nessler. Un resultado positivo se manifiesta con un color rojo (indicando pH elevado), mientras que un resultado negativo es amarillo.
• Indicar el número de tubos positivos y la serie de dilución (10, 1 o 0,1 mL). Consultar la tabla de NMP e indicar el resultado en NMP/100 mL.
• Además, observar la fluorescencia de los medios de Agar Cetrimida bajo luz UV e indicar las placas que fueron positivas.
• Si el tubo con reactivo de Nessler fuera positivo, pero la placa de Cetrimida fuera negativa, se procedería a sembrar en Medio King B o mediante un sistema API. El Medio King B potencia la producción de fluoresceína (visible con UV). Incubar a 35 °C durante 24 horas.

Consideraciones sobre los Medios de Cultivo:

• Caldo Asparagina: Medio de enriquecimiento, pueden crecer otros microorganismos.
• Caldo Acetamida: Prueba confirmativa de fluorescencia.
• Agar Cetrimida: Inhibe el crecimiento de otros microorganismos, utilizado en el método de filtración por membrana.

Pruebas Bioquímicas para la Identificación Bacteriana

1. Reacción de Gram (Método KOH)

• Procedimiento: 10 µL de KOH al 3% + inóculo.
• Resultados:
  • Sin viscosidad: Gram positivo (+)
  • Con viscosidad (filancia): Gram negativo (-)

2. Agar Movilidad (0,4% Agar)

• Procedimiento: Siembra por picadura. Incubar a 35 °C durante 24 horas.
• Resultados:
  • Bacterias inmóviles: Crecen solo en la línea de picadura.
  • Bacterias móviles: Crecen por todo el medio.

3. Prueba de la Oxidasa

• Procedimiento: Aplicar reactivo de Kovac sobre una colonia en un papel de filtro.
• Principio: Detecta enzimas oxidasa que actúan sobre el citocromo c.
• Resultados:
  • Azul (< 10 segundos): Se oxida (positivo +)
  • Incoloro: No se oxida (negativo –)

4. Prueba de la Catalasa

• Procedimiento: Añadir peróxido de hidrógeno (H₂O₂) al 30% sobre el inóculo en un portaobjetos.
• Principio: Detecta enzimas catalasa.
• Resultados:
  • Con burbujas: Catalasa positiva (+)
  • Sin burbujas: Catalasa negativa (-)

5. Prueba ONPG

• Procedimiento: Tubo con disco ONPG + 100 µL de SSF + inóculo. Incubar a 35 °C durante 6-24 horas.
• Resultados:
  • Amarillo: Tiene β-galactosidasa (fermentador de lactosa)
  • Blanco: No tiene β-galactosidasa

6. Agar Hierro de Kligler (KIA)

• Composición: El medio contiene lactosa, glucosa y citrato férrico amónico.
• Procedimiento: Siembra por picadura y estriado + inóculo. Incubar a 35 °C durante 18 horas.
• Principio: Detecta la fermentación (acidificación) de glucosa y lactosa, la producción de gas a partir de glucosa y la producción de H₂S.
• Resultados:
  • Solo la parte superior amarilla: Lactosa positiva (+)
  • Solo la parte inferior amarilla: Glucosa positiva (+)
  • Ambas partes amarillas: Glucosa y lactosa positivas (+)
  • Desplazamiento del medio o burbujas: Producción de gas a partir de glucosa.
  • Precipitado negro: Productor de H₂S.

7. Oxidación/Fermentación (O/F)

• Procedimiento: 2 tubos de medio OF de Hugh y Leifson (1%) con azúcares y alcoholes + inóculo. Añadir parafina en un tubo al final (para crear anaerobiosis). Incubar a 35 °C durante 48 horas.
• Resultados:
  • Amarillo: Metabolismo oxidativo de azúcares o alcoholes (acidificación).
  • Verde: No utiliza azúcares ni alcoholes.
  • Tubo con parafina verde, tubo sin parafina amarillo: Aerobio oxidativo.
  • Tubo con parafina amarillo, tubo sin parafina verde: Anaerobio estricto.
  • Tubo con parafina amarillo, tubo sin parafina amarillo: Anaerobio facultativo fermentativo.

8. Prueba del Citrato

• Procedimiento: Siembra por estría en la superficie del Agar Citrato de Simmons (verde) + inóculo. Incubar a 35 °C durante 48 horas.
• Principio: Determina si la bacteria utiliza el citrato como única fuente de carbono.
• Resultados:
  • No hay cambio de color: Negativo (-)
  • Azul en la superficie inclinada: Positivo (+)

9. Descarboxilación de Aminoácidos (AA)

• Procedimiento: Tubos de caldo Moeller (arginina, lisina, ornitina) + inóculo + parafina en todos al final. Incubar a 35 °C durante 2-4 días.
• Principio: Capacidad de descarboxilar aminoácidos para formar una amina que alcaliniza el medio.
• Control: Contiene glucosa pero no aminoácidos; permanece amarillo por la fermentación de glucosa.
• Resultados:
  • Amarillo: Acidificación por fermentación de glucosa (negativo –)
  • Púrpura: Alcalinización por descarboxilación de aminoácidos (positivo +)

10. Prueba del Indol

• Procedimiento: Tubo de caldo de triptona (AT) + inóculo + reactivo de Kovac para indol. Incubar a 35 °C durante 24-48 horas.
• Principio: Capacidad de producir indol a partir de triptófano.
• Resultados:
  • Anillo rojo superficial después de añadir el reactivo: El reactivo reacciona con indol (positivo +)
  • Sin color superficial: No hay indol (negativo –)

11. Prueba del Rojo de Metilo (RM)

• Procedimiento: Tubo con caldo Rojo de Metilo-Voges Proskauer (RM/VP) + inóculo + reactivo Rojo de Metilo al final. Incubar a 35 °C durante 48 horas.
• Principio: Detecta la formación de ácidos estables a partir de glucosa (fermentación). El rojo de metilo actúa como indicador de pH.
• Resultados:
  • Rojo: (positivo +)
  • Sin cambio de color (amarillo): (negativo –)

12. Prueba de Voges-Proskauer (VP)

• Procedimiento: Tubo con caldo Rojo de Metilo-Voges Proskauer (RM/VP) + inóculo + reactivo α-naftol + 1 gota de KOH (40%). Agitar el tubo para exponer al O₂ (oxidar acetoína). Incubar a 35 °C durante 48 horas a varios días.
• Principio: Capacidad de producir un producto neutro (acetilmetilcarbinol o acetoína) mediante la fermentación de glucosa.
• Resultados:
  • Rojo: Oxidación de acetoína, produce producto neutro (positivo +)
  • Sin cambio de color: No hay reacción, no produce producto neutro (negativo –)

13. Licuefacción de Gelatina

• Procedimiento: Tubo de gelatina (Ge) + inocular por punción. Incubar junto con un tubo control sin inocular a 25 °C durante 1-7 días.
• Principio: Capacidad de producir gelatinasa.
• Resultados:
  • Gelatina líquida: Gelatinasa positiva (+)
  • Gelatina sólida: Gelatinasa negativa (-)

14. Producción de Lecitinasa

• Procedimiento: Agar Yema de Huevo (AYH) + inóculo. Incubar a 35 °C durante 1-4 días.
• Principio: Capacidad de producir lecitinasa, de hidrolizar la lecitina de la yema de huevo.
• Resultados:
  • Halo opaco alrededor de la colonia: Lecitinasa positiva (+)
  • Sin halo: Lecitinasa negativa (-)

15. Tolerancia a la Sal

• Procedimiento: Tubo Caldo Peptona con 6,5% NaCl + inóculo. Incubar a 35 °C durante 48 horas.
• Principio: Capacidad de crecer con NaCl al 6,5%.
• Resultados:
  • Crecimiento: Tolerante (positivo +)
  • No crecimiento: No tolerante (negativo –)

16. Tolerancia al Calor

• Procedimiento: Tubo Caldo Tripticasa Soja (TSB) + inóculo. Incubar a 42 °C durante 24 horas.
• Principio: Capacidad de una bacteria de crecer a 42 °C.
• Resultados:
  • Crecimiento: Tolerante (positivo +)
  • No crecimiento: No tolerante (negativo –)