Microscopía Óptica: Herramienta Esencial en Biología

Historia y Evolución del Microscopio

El microscopio es un instrumento básico para el estudio de la Biología, que permite percibir detalles de organismos y estructuras que no podrían ser observados directamente por simple inspección ocular. Para ello, es necesario disponer de lentes de aumento. Estas lentes se conocen desde tiempos de Arquímedes, pero la óptica como disciplina comenzó a desarrollarse en el siglo XIII con el monje franciscano Roger Bacon.

Antony van Leeuwenhoek (siglo XVII), comerciante holandés, utilizando microscopios simples de fabricación propia, describió protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. El primitivo microscopio tenía dos lupas combinadas con las que llegó a alcanzar 260 aumentos, lo cual le permitió visualizar algunos protozoos e infusorios.

Microscopios del Siglo XVIII y Avances Clave

• Ernst Abbe: Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del microscopio.
• Carl Zeiss: Mejora la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener 2000 aumentos.

La palabra «Microscopio» proviene del griego Mikrós (pequeño) y skopéin (observar). Los microscopios son instrumentos ópticos que nos permiten ver objetos muy pequeños o detalles estructurales imposibles de distinguir a simple vista, por debajo del límite de resolución.

La mayoría de las observaciones microscópicas se realizan sobre células muertas que han sido procesadas para:

• Eliminar el agua.
• Preservar su estructura.
• Dar contraste a sus componentes.
• Obtener una sección delgada para que la luz pueda atravesarla.

Otras veces se observan células vivas.

Parámetros Ópticos Fundamentales

• Aumento: Se calcula como el aumento del objetivo × aumento del ocular.
• Poder de Resolución: Distancia mínima a la que se pueden discriminar dos puntos. Es mayor cuanto menor es la longitud de onda, mayor es la apertura numérica y mayor con aceite de cedro.
• Número de Campo: Es el diámetro de la imagen observada a través del ocular, en milímetros.
• Profundidad de Campo: Zona comprendida entre el punto más cercano y el más lejano de nuestro campo que sea aceptable en cuanto a nitidez, una vez formada la imagen en el mismo plano de enfoque.
• Contraste: Diferencia de absorción de luz entre el objetivo y el medio, puede aumentarse con las tinciones.

Los microscopios nos permiten obtener imágenes de la morfología externa o interna de la célula. Los conocimientos sobre las estructuras celulares y tisulares se han obtenido básicamente con la ayuda de tres instrumentos principales: Microscopio Óptico (MO), Microscopio Electrónico de Transmisión (MET) y Microscopio Electrónico de Barrido (MEB). Cada uno de ellos nos aporta un tipo de información acerca de la morfología de la célula.

Tipos de Microscopios Ópticos

Microscopio Simple (Lupa o Microscopio Estereoscópico)

Es un aparato de una sola lente o sistema de lentes convergentes biconvexas (parte óptica) sostenidas por un soporte con tornillos de enfoque. Sus aumentos varían entre 2X y 20-30X. La magnificación depende del aumento proporcionado por los oculares y el sistema de acercamiento (zoom). Se usan como auxiliares en la observación o disección de piezas anatómicas pequeñas.

Microscopio Óptico Compuesto (Convencional, de Campo Claro o Microscopio Fotónico)

Usa una luz blanca que atraviesa la muestra biológica e ilumina el campo de observación. La muestra debe ser lo suficientemente fina como para que la luz pueda atravesarla. Los detalles estructurales se visualizan debido a las diferencias de absorción de la luz. Este microscopio se usa para observar preparaciones histológicas coloreadas. Tiene tres sistemas de lentes:

• Condensador: Enfoca los rayos de luz sobre las muestras.
• Objetivos: Magnifican la imagen.
• Oculares: Agregan mayor magnificación y permiten la visualización directa del preparado.

Para su estudio, se divide en dos partes:

Parte Mecánica:

• Pie o base: Estable, sólido y amplio.
• Columna (brazo): Sostiene el tubo y la platina.
• Tubo: Con los oculares y los objetivos.
• Platina: Lugar donde se disponen las muestras.
• Tornillos de enfoque: Permiten regular la distancia entre la muestra y los objetivos; hay dos: macrométrico y micrométrico.
• Soportes para el condensador, diafragma y filtros.

Parte Óptica:

• Sistema de iluminación: Fuente de luz, lámpara halógena de intensidad graduable o lámparas LED, con interruptor. En el exterior puede tener un filtro.
• Lentes: Objetivos y oculares, condensador (concentra la luz de la lámpara en un punto de la preparación) y diafragma (o iris, está dentro del condensador; si se cierra, mejor será el contraste pero empeorará la resolución). Están colocados en el revólver, tienen un sistema de amortiguación, un anillo coloreado indicando los aumentos, están recubiertos por un sistema metálico y en ellos se inscriben todos sus datos.

Objetivos:

Distintos aumentos: 3.5X, 4X, 5X, 10X, 25X, 40X o 45X, 100X. Se suele usar el de 100X con una gota de aceite de cedro o sustancia con índice de refracción semejante al del vidrio. Son sistemas de lentes convergentes, corregidos para las aberraciones cromática y esférica.

Oculares:

Es la lente que recoge la imagen dada por el objetivo, a partir de la cual origina una imagen aumentada, virtual y derecha. Está recubierto por un cilindro metálico y tiene grabado el aumento que proporciona. El ocular está formado por un sistema de lentes en el que destacan la lente inferior de campo y la lente superior. En el MO binocular, la separación entre los oculares puede regularse adecuando la distancia interpupilar del operador. El aumento final que proporciona un MO puede calcularse multiplicando la magnificación del objetivo utilizado por la del ocular. Los más usados son los de 10X.

Preparación de Muestras para Microscopía Óptica

1) Fijación de la Muestra

El objetivo es mantener la célula en buen estado sin que se pudra o se oxide, de manera que su estructura morfológica sea lo más fiel a la realidad posible. Existen 2 tipos:

• Física (Criofijación): Mediante CO₂ o inmersión en nitrógeno líquido. Se lleva a cabo a bajas temperaturas para conseguir que la muestra se congele muy rápidamente (se necesita mantener la muestra congelada continuamente).
• Química: Formol 10%, Bouin o alcohol 70%. Se sumerge la muestra en preparaciones de formol o alcohol de aproximadamente 1 cm³ y duran aproximadamente 24 horas.

2) Inclusión en Parafina

• Lavado: Para limpiar las muestras y así sumergirlas en una disolución de tampón fisiológico dos o tres veces. De esta manera, se le quitan los residuos del fijador.
• Deshidratación con alcohol (70°, 80°, 90°, 100°): Para eliminar el exceso de agua de la preparación. Se introducen las preparaciones en alcohol de manera gradual.
• Aclaramiento con propanol o butanol: Se utiliza para eliminar los restos de sangre y pigmentos, pero sobre todo supone un endurecimiento de las muestras, ya que permite que se infiltre la parafina de la preparación.
• Infiltración con parafina a 60°C: Hay que sustituir los alcoholes que hay en la preparación por parafina. Para ello, se calienta la parafina en una estufa donde se introducirán las preparaciones una vez alcanza la temperatura.
• Confección de los bloques de parafina: Sacamos la muestra y la dejamos sobre una caja, la cual llenamos de parafina hasta el borde. Dicha caja se sitúa sobre una placa fría que está a una temperatura de 4°C para que solidifique la parafina rápidamente.

3) Preparaciones Histológicas: Realización de Cortes

Con el Micrótomo (para fijaciones químicas) podemos elegir el grosor del corte (entre 5 y 10 micras). Enganchamos la preparación con una mordaza para que no se mueva y a continuación giramos una manivela para que pase la cuchilla y hacer así el corte. Después introducimos la preparación en un baño de agua caliente para estirarla y fijar así la muestra al portaobjetos. Una vez realizado esto, dejamos secar las preparaciones en unas estructuras sobre una estufa durante toda una noche a 37 grados. Finalmente, las preparaciones se rotulan con etiquetas o con unos portaobjetos que incluyen una banda mate y así poder almacenarlas. Una vez almacenadas, hay que preservarlas de la humedad y del polvo.

Con el Criótomos (para fijaciones físicas), el proceso de corte y preparación ocurre de la misma manera. Sin embargo, la muestra y la cuchilla se localizan dentro de una cámara a temperaturas muy frías, comprendidas entre -20°C y -80°C, para que se pueda cortar sin que la muestra se desestabilice. Además, no hay ningún aparato que agarre nuestra muestra, por lo que se fija con unas gotas de azúcar.

A continuación, se manipula la muestra ya cortada y congelada con unos guantes especiales, y se junta a un portaobjetos. Cabe destacar que esta muestra se va a adherir simplemente por contacto al portaobjetos y se va a guardar directamente en un congelador. Una vez realizados los cortes en los bloques, se pegan en un portaobjetos y se estiran. Este pegado se realiza con Albúmina-glicerina, Silano o Poli-L-lisina.

Posteriormente, se dejan secar para su posterior hidratación con Xilol, seguido de alcohol y finalmente con agua. Seguidamente, se lleva a cabo la tinción de la muestra para poder observarlas mejor. Para ello, utilizamos Hematoxilina-Eosina, Orceína o Tricrómico. Nuevamente, se lava la muestra con agua y se rehidrata gradualmente con alcohol hasta llegar al Xilol. Por último, se produce el montaje del cubreobjetos.

Microscopios Ópticos Especializados

Microscopio de Campo Oscuro

Condensador especial que dirige los rayos luminosos desde la parte lateral. Las lentes del microscopio solo reciben la luz dispersada por los diferentes componentes celulares, por lo que las estructuras aparecen brillantes sobre un fondo oscuro. Se utiliza para la observación de células vivas (células en cultivo) y móviles como bacterias y espermatozoides. Aunque tiene similar límite de resolución que un MO de campo claro, mejora la visualización. Así, por ejemplo, una célula en cultivo puede mostrar brillantes el nucléolo, envoltura, mitocondrias o gotitas lipídicas.

Microscopio de Contraste de Fases

Permite observar células y tejidos sin colorear. Se usa especialmente para el examen de células vivas. Se basa en la existencia de pequeñas diferencias en el índice de refracción de diferentes partes de la célula y tejidos. Por ello, no es necesario usar tinción. Adición de un diafragma anular ubicado en el condensador para iluminar el objeto con un cono de luz estrecho. Por interferencia entre los rayos de luz provenientes de las diferentes regiones del objetivo y aquellos influenciados por el anillo de fase, se logran imágenes diferenciadas que no se podrían ver con un MO normal.

Microscopio de Interferencia (DIC)

Modificación del microscopio de contraste de fases. La luz se divide en dos haces, uno que atraviesa la muestra y otro que pasa lateralmente y es tomado como referencia. Luego, estos haces vuelven a unirse e interfieren entre sí. Mediante accesorios ópticos especiales, se obtiene una imagen bien contrastada, con un efecto de relieve característico. Es muy usado en cultivos celulares. La microscopía de interferencia o técnica DIC (Differential-Interference Contrast) de Nomarski, permite la visualización de especímenes mucho más densos gracias a que la imagen proyectada es tridimensional.

Microscopio de Polarización

Se les han añadido dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el observador). El material que se usa para ello es un cristal de cuarzo o un cristal de Nicol, dejando pasar únicamente la luz que vibra en un único plano (luz polarizada). Esta luz produce en el campo del microscopio claridad u oscuridad, según que los dos nicoles estén paralelos o cruzados. Permite diferenciar detalles debido a las características isotrópicas (mismo índice de refracción en todas las direcciones) y anisotrópicas (modifican el plano de luz polarizada y envían rayos luminosos a través del analizador). Los materiales isotrópicos se ven oscuros. Los anisotrópicos (ej. moléculas fibrosas como el citoesqueleto) aparecen brillantes, con colores que dependen de la diferencia de espesor de las preparaciones.

Microscopio Invertido

Tienen el revólver portaobjetivos debajo de la platina y el sistema de iluminación se encuentra por encima. Permite tener una amplia distancia de trabajo. Se utiliza para el seguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicación, contaminación. Control sobre cambios morfológicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc.).

Microscopio de Fluorescencia

Los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos. La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es expuesta a radiaciones del tipo ultravioleta, rayos catódicos o rayos X. Las radiaciones absorbidas (invisibles al ojo humano) son transformadas en luz visible, o sea, de una longitud de onda mayor al incidente. La fluorescencia ocurre cuando un átomo vuelve a su estado fundamental después de haber estado excitado eléctricamente.

Aplicaciones de la Microscopía de Fluorescencia:

La microscopía de fluorescencia de tejidos, células o estructuras subcelulares es lograda marcando el anticuerpo con un fluorocromo y permitiendo que este encuentre su antígeno correspondiente presente en la muestra. Al marcar varios anticuerpos con diferentes fluorocromos, se puede lograr la visualización de múltiples objetivos dentro de una misma imagen (doble marcaje). Otras aplicaciones incluyen:

• Microscopía Confocal
• Citometría de Flujo
• Hibridación in situ
• Inmunohistoquímica
• PCR en tiempo real

Microscopio Confocal

Emplea una técnica óptica de imagen para incrementar el contraste y/o reconstruir imágenes tridimensionales utilizando diferentes elementos para eliminar la luz desenfocada o destellos de la lente en especímenes que son más gruesos que el plano focal. Combina partes de un MO, al que se adapta un equipo fluorescente con un sistema de barrido en el que se emplea un rayo láser. Mediante un ordenador se registran los datos y se obtiene una sección óptica muy delgada. Pueden lograrse imágenes de la muestra a diferentes profundidades y luego el ordenador reconstruye la imagen. Puede captar hasta tres fluorocromos diferentes de manera simultánea.

Microscopio de Deconvolución

Surgió inicialmente como una alternativa más económica a la microscopía confocal, aunque hoy en día se aplica tanto a imágenes adquiridas en los sistemas confocales como en los de fluorescencia convencional. Un programa informático es capaz de interpretar la información recogida mediante la adquisición de imágenes procedentes de diferentes planos de la preparación (secciones ópticas), eliminando la luz fuera de foco y las aberraciones ópticas del sistema. De esta manera, se mejora significativamente la calidad de la imagen, proporcionando una imagen más limpia y contrastada donde es posible distinguir un mayor número de detalles. Para trabajar con estos programas se necesitan ordenadores de gran potencia, ya que requieren un enorme número de cálculos matemáticos que deben correr a velocidades lo suficientemente altas como para poder obtener resultados en un tiempo razonablemente corto. De esta manera, los ordenadores suelen disponer de más de un procesador y de un tamaño de memoria bastante elevado.

Microscopía Electrónica: Explorando el Nanomundo

Antecedentes Históricos de la Microscopía Electrónica

• De Broglie (1924): Describió el movimiento de los electrones.
• Busch (1926): Observó que los campos magnéticos con la dimensión y forma apropiada pueden utilizarse como lentes para enfocar un haz de electrones.
• Knoll y Ruska (1932): Diseñaron el primer Microscopio Electrónico (ME) con dos lentes electromagnéticas de aumento y un haz de electrones.
• 1935: Se diseñó el primer ME de alta resolución.
• 1939: En Alemania (Siemens y AEG) se comercializaron los primeros ME (muy caros).

Composición de un Microscopio Electrónico de Transmisión (MET)

Una columna con:

• Fuente de iluminación: Cañón de electrones, sistema que genera un flujo de electrones con la velocidad y dirección adecuadas.
• Un filamento o cátodo de wolframio: Este se encuentra conectado a una fuente de alta tensión donde la diferencia de potencial ánodo-cátodo hace que los electrones adquieran energía y estos son acelerados hacia el ánodo. Cabe destacar que el cilindro protector tiene la base perforada, garantizando la orientación correcta de los electrones.
• Un ánodo perforado.
• Un cilindro protector (cilindro de Wehnelt).
• Las lentes: Son bobinas electromagnéticas por las que circula corriente eléctrica generando un campo electromagnético. Los primeros microscopios incluían tres lentes (condensador, inyector de muestra -que se sitúa entre el condensador y el objetivo-, objetivos y lente proyectora). Los microscopios modernos poseen más lentes (dos o más condensadores, lentes intermedias y dos o más lentes proyectoras). Las lentes intermedias y proyectoras se sitúan por debajo, magnifican la imagen obtenida y aumentan los aumentos en función del campo magnético obtenido. Además, existen elementos que son atravesados por el haz de electrones.
• Sistema de visualización.
• Un sistema de vacío.
• Una fuente de alta tensión eléctrica.
• Un sistema de refrigeración.
• Un control de mandos.

Portaobjetos en MET

Se utilizan rejillas de cobre, níquel o rodio. El haz de electrones no atravesaría el vidrio y los obstáculos al paso de los electrones que podemos encontrar son la propia muestra y el entramado de la rejilla. Para visualizar la imagen originada por los electrones es necesario convertir la imagen visible por el ojo humano. Esta imagen se puede obtener a través de dos maneras:

• Una visualización directa en una pantalla fluorescente.
• Mediante la génesis de una imagen fotográfica o digitalizada.

Resolución de un Microscopio Electrónico

Poder de Resolución:

Capacidad de distinguir como dos imágenes distintas dos puntos muy cercanos. Distancia mínima entre dos puntos para que puedan distinguirse:

• Ojo humano: 0,23 mm = 230 µm = 23 × 10⁴ nm
• Microscopio Óptico: 0,23 µm = 230 nm
• Microscopio Electrónico: 0,23 nm

Ecuación de Abbe: LR (límite de resolución) = 0,61 × λ (longitud de onda) / AN (apertura numérica del objetivo = n sen α), donde n es el índice de refracción del medio y α es ½ del ángulo de incidencia de la radiación.

Ecuación de Broglie: λ = h (constante de Planck) / (m (masa de la partícula) × V (voltaje aplicado)).

Al emitirse un haz de electrones puede ocurrir:

• Transmisión de electrones a través de la muestra.
• Retrodispersión de electrones (electrones primarios).
• Emisión de electrones de la propia muestra (electrones secundarios).
• Emisión de otras radiaciones.

Mientras que para la Formación de la Imagen: los electrones no dispersados descienden hasta impactar con la pantalla (formando la imagen) y los electrones dispersados, dependiendo del ángulo, pueden abandonar el campo de visión.

Preparación de Muestras para MET

Inclusión y Corte Fino

Partimos de una muestra de un tamaño de 1 mm³ donde utilizaremos resinas que polimerizan con calor. Para llevar a cabo este proceso, seguimos los siguientes pasos:

1. Fijamos la muestra para preservarlas a través de 2 procesos distintos:
   • Fijación física (criofijación) mediante frío (propano líquido, nitrógeno líquido o impacto metálico): metemos nuestra muestra a -80°C.
   • Fijación química: mediante glutaraldehído 2%, paraformaldehído 6% (preserva antígenos) o mezclas de fijadores.
2. Post-Fijación con tetróxido de osmio 1%, donde observamos que las muestras se vuelven negras.
3. Inclusión de Resina: Para ello, lavamos la muestra, deshidratamos con acetona o metanol y a continuación aclaramos con óxido de propileno. Finalmente, infiltramos con resinas acrílicas o epoxi (para estudiar ultraestructuras) y confeccionamos los bloques.
   • Confección de bloques: Para ello, utilizamos moldes de resina o cápsulas transparentes (mismo tamaño que un medicamento). No se deshacen nunca.
   • Quitamos la resina que sobra y nos quedamos con la zona de la muestra.
4. Preparación de Rejillas:
   • Realización de cortes con ultramicrótomo (cuchillas de vidrio que se fabrican en el mismo laboratorio) o ultracriótomos (protegido con una caja y contiene nitrógeno líquido).
   • Realización de semifinos (0.5 a 1-2 micras de grosor) con el ultracriótomos, con cuchillas de vidrio. Utilización de pinzas con punta muy fina o cierre inverso.
   • Realización de ultrafinos (10 a 100 nm de grosor) con el ultramicrótomo, con cuchillas de vidrio o de diamante. Utilización de pinzas con punta fina o cierre inverso.
   • En las rejillas podemos meter hasta un máximo de 6 cortes. En ocasiones se ponen pegamentos en la rejilla (nitrocelulosa, formvar o carbono). Guardamos las rejillas en un portarrejillas.
5. Contraste de los Cortes: Mediante acetato de uranilo, lavado, citrato de cromo, lavado y secado. Donde observaremos las muestras en tonalidades de grises.

Desintegración y Obtención de Extensiones

Deben ser extensiones finas para estudiarlas con distintos métodos de contraste:

• Contraste Negativo de Extensiones: Primero fijamos la extensión, luego embebemos el material en fase líquida que rodea a las partículas para que al final, cuando se seque, se forme una película densa de electrones. Los materiales que utilizamos son sales de metales pesados muy solubles en agua (no precipita) y de pequeño tamaño: fosfotungstato, de uranilo, de cadmio o de molibdeno.

Observamos: Las partículas se observan claras y rodeadas de material oscuro (efecto contrario), dando un aspecto tridimensional resaltando el relieve de la muestra.

• Sombreado Metálico: Se usan metales pesados, pero no sus sales. El metal se evapora sobre su superficie, solo a un lado de la muestra y queda la sombra del otro lado. Los metales usados son platino, paladio, iridio, tungsteno o tántalo (observamos macromoléculas como filamentos, ácidos nucleicos o virus).

Observamos: La imagen que se observa es la de un objeto oscuro junto a una sombra clara donde se pueden obtener imágenes invertidas. La imagen puede ser unidireccional (un foco de evaporación) o rotatorio (la estructura queda bien delimitada).

Réplicas de Superficie

Consiste en la copia de la superficie (una copia fina y transparente) que observaremos al TEM y donde utilizaremos materiales plásticos (muy resistentes), carbono o similares. La separación se realiza a través de medios químicos como disolución, oxidación o digestión de la muestra.

Criotécnicas

El principal objetivo de esta técnica es reducir los cambios que hayamos introducido a través de métodos químicos convencionales. Para ello, se empieza por una criofijación.

• Ventajas: Se reduce la pérdida de componentes solubles (no hay extracción) y se conserva mejor la conformación molecular (facilidad de detectar antígenos).
• Desventajas: Necesitan de un aparataje especial y no suelen ser rutina (ej: criofractura o criograbado).

Criofracturas:

Cuando trabajamos con material congelado no se produce un corte limpio de la muestra y por tanto deberemos realizar criofracturas. Los pasos a seguir:

1. Criofijación.
2. Fractura: Criofractura o criograbado (antes de pasar a la réplica, deberemos de sublimar en hielo en vacío). Con el criograbado podemos comparar ambas muestras mientras que con la criofractura solo observamos una muestra.
3. Réplica.
4. Eliminamos la muestra biológica.
5. Sombreado.

Microscopía Electrónica de Barrido (MEB)

Composición del MEB

Este tipo de microscopía está formada principalmente por dos lentes, un condensador y un generador. Además, el microscopio está conectado a la luz junto a un ordenador. Observamos las siguientes partes:

• Una fuente de electrones que ilumina la muestra y está formado por un filamento de wolframio que es calentado para originar la luz.
• Un sistema óptico que consta de dos lentes magnéticas cuya función es focalizar lo máximo posible la fuente de electrones.
• Un juego de tornillos que permite que la radiación sea movida sobre la superficie de la muestra.
• Un portamuestras cuya resolución obtenida por el microscopio depende de las propiedades de estas lentes y su distancia a la muestra.
• Un sistema de detección.

Obtención de la Imagen en MEB

Al contrario que en el MET, la imagen se forma por los electrones que no atraviesan la muestra (los retrodispersados), junto con los electrones secundarios.

• Electrones Secundarios: Son recogidos por un sensor capaz de relacionar la incidencia de los electrones con el relieve de la muestra, formando una imagen de superficie.
• Electrones Retrodispersados: Son los primarios que rebotan en la muestra y son recogidos también por el sensor, contribuyendo en la formación de la imagen.

Preparación de la Muestra para MEB

1. Fijación con formaldehído, paraformaldehído y glutaraldehído.
2. Deshidratación.
3. Punto Crítico: El secado al punto crítico (SPC) es el método más confiable y con menos artefactos. Se lleva a cabo una deshidratación extrema, ya que esta técnica se basa en que a ciertas condiciones de temperatura y presión, un fluido iguala la densidad de su fase líquida con la de vapor, de tal forma que es posible llevar un líquido a la fase vapor sin que exista tensión en la superficie de la muestra. Proceso útil en muestras blandas o muy hidratadas y se utiliza CO₂ para llevar a cabo este proceso, puesto que es el líquido cuyo punto crítico (31°C, 1072 psi) puede lograrse con relativa facilidad en condiciones de laboratorio (lo realizan los técnicos).
4. Colocación en portamuestras (lo realizamos nosotros mismos).
5. Metalizado: Para hacer conductiva una muestra, se aplica una capa muy delgada de metal de alto número atómico. El metal de la laminilla preferentemente es oro o una aleación de oro-paladio. Se escogen estos dos metales por tener la característica de formar partículas muy finas, además del alto número atómico de estos metales le imparte mayor conductividad a la muestra, emitiendo una señal más fuerte para formar su imagen. El grosor de la capa que llega a formarse sobre la muestra es de aproximadamente 20 nm.

Nuevos Equipos y Técnicas de Microscopía Avanzada

• STEM: Combinación de MET y MEB.
• SPM: Microscopio de sonda de barrido (átomos y moléculas).
• Microscopio Óptico de Campo Próximo: Diseño óptico y mecánico similar al del microscopio confocal. Su funcionamiento está basado en un sensor de fuerza lateral al cual se adhiere una fibra óptica afilada.
• Microscopio de Efecto Túnel (STM): Microscopio cuántico que forma parte de los instrumentos llamados nanoscopios porque posibilitan ver objetos del tamaño en nanómetros y aún menores. Se conoce como «microscopio de barrido de efecto túnel» (STM) y fue presentado en 1982 por Binnig y Röhrer. Ambos recibieron por esto el Premio Nobel de Física en 1986. En una instalación cuyo fin es tomar medidas en escala atómica, es necesario que el elemento que se usa como sonda de medida tenga una resolución de esa misma escala. En un microscopio de efecto túnel, la sonda es una punta conductora, por ejemplo, de Wolframio. La punta se trata para eliminar los óxidos y para que sea lo más afilada posible. En condiciones ideales, hay un solo átomo en el extremo de la sonda. La instalación consiste en un circuito eléctrico en el que están incluidos la muestra y la punta de medida. Como se ha apuntado anteriormente, el parámetro de medida es la intensidad de corriente túnel. Esta intensidad apenas alcanza los nanoamperios y, además, es muy sensible tanto a la distancia como a la diferencia de tensión entre la punta y la muestra. Debido a esta sensibilidad, todo el sistema debe estar controlado electrónicamente. Así, la toma de medidas y los movimientos de la punta (realizados mediante un dispositivo piezoeléctrico con precisiones que pueden llegar a los 0.05 nm) son controlados por el usuario, a través de las interfaces correspondientes, por ejemplo: mediante un PC de sobremesa.
• Microscopio de Fuerza Atómica (AFM): Instrumento mecano-óptico capaz de detectar fuerzas del orden de los piconewtons. Al rastrear una muestra, es capaz de registrar continuamente su topografía mediante una sonda o punta afilada de forma piramidal o cónica. La sonda va acoplada a un listón o palanca microscópica muy flexible de solo unos 200 µm. El microscopio de fuerza atómica ha sido esencial en el desarrollo de la nanotecnología, para la caracterización y visualización de muestras a dimensiones nanométricas (1×10⁻⁹m = 1nm).
• Microscopio de Resonancia Magnética (MRFM): Está concebida para observar las estructuras atómicas tridimensionales de las moléculas. El concepto combina las ideas de proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) y microscopía atómica de la fuerza (AFM). Trabaja en escalas del nanómetro, y posiblemente en el futuro trabajará en escalas atómicas. Nos permite observar la estructura de las proteínas.

Inmunotécnicas: Detección y Localización de Proteínas

Las técnicas inmunocitoquímicas consisten en la detección y localización de antígenos utilizando anticuerpos que reconocen específicamente ese antígeno. Se basan en la unión específica Antígeno-Anticuerpo.

Conceptos Fundamentales en Inmunología

• Antígeno: Sustancia extraña que entra en nuestro organismo. Conlleva la producción de anticuerpos.
• Epítopo o determinante antigénico: Región del antígeno que estimula la producción de anticuerpos. Es la región reconocida por los anticuerpos.
• Especificidad: Capacidad de un anticuerpo (Ac) de reconocer su antígeno (Ag) y no otro.
• Afinidad: Fuerza o intensidad de unión.
• Reacción cruzada: Cuando un Ac frente a un determinado Ag se une con otro Ag diferente, pero estructuralmente relacionado.
• Sensibilidad: Se refiere a un método inmunohistoquímico y se define como la mínima cantidad de antígeno que se puede detectar con dicho método. Depende de varios factores, entre otros, del antisuero primario (título, afinidad, etc.), antisuero secundario, método de visualización, etc.
• Inmunogenicidad: Capacidad que presenta una molécula para generar una respuesta inmune en un organismo dado.
• Antigenicidad: Particularidad del antígeno que hace que este sea reconocido por un determinado anticuerpo.

Los anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Ig) son glucoproteínas presentes en el suero producidas por los linfocitos B en respuesta a una estimulación antigénica.

Tipos de Anticuerpos

Anticuerpos Policlonales

Es una mezcla de diferentes Ac frente a distintos epítopos de un mismo antígeno y se obtienen por exposición de un vertebrado superior a dicho antígeno. Para ello:

1. Se inyecta al animal el Ag procedente de una especie distinta.
2. Los linfocitos reaccionan y generan una batería de Ig dirigidas frente a distintos epítopos.
3. Tras la inmunización se realiza un sangrado periódico. La sangre se centrifuga para eliminar células y el fluido contiene los Acs.
4. Se purifica el fluido y se obtiene el antisuero policlonal enriquecido.

Ventajas:

• Espectro de reactividad mayor.
• Producción más sencilla.

Inconvenientes:

• Reconocen varios epítopos de la misma molécula y por tanto mayor probabilidad de reacción cruzada.
• Imposible de reproducir exactamente los mismos resultados de la inmunización.
• La purificación es laboriosa.

Anticuerpos Monoclonales

Todos los anticuerpos del suero son idénticos: misma especificidad, misma afinidad, mismo epítopo, …

1. Se inmuniza al animal (ratón).
2. Se extrae el bazo del animal y se disgrega para obtener Linfocitos B.
3. Estos se fusionan con células de mieloma. Se crea un hibridoma.
4. Se selecciona el hibridoma.
5. Las células se clonan (una sola célula).
6. Se realizan cultivos.
7. Se obtiene el anticuerpo a partir de los sobrenadantes de los cultivos.

Ventajas:

• Fuente ilimitada de Ac.
• Alta especificidad.
• No es necesaria la purificación.

Inconvenientes:

• La fijación y procesamiento de las muestras en IHQ puede alterar el epítopo.
• Alta especificidad que hace que a veces no se puedan aplicar en distintas especies.
• Proceso de obtención mucho más laborioso.
• Los títulos son muy bajos, por lo tanto, hay que concentrarlos más.

Marcadores en Inmunocitoquímica

• Enzimas: Que precipitarán sustratos específicos, de manera irreversible (MO y ME).
• Fluorocromos: Captan luz a una longitud de onda (al excitarse) y emiten luz a una longitud de onda mayor (al desexcitarse, MO).
• Ferritina: En ME (12nm Ø), unido a Ig.
• Oro coloidal: Partículas de tamaños variables (2nm a 150nm) unidas a Ig o Proteína A.

Para MO: enzimas y fluorocromos. Para ME: enzimas, ferritina y oro coloidal.

Técnicas Inmunoenzimáticas

Métodos basados en la peroxidasa:

• Complejos peroxidasa-antiperoxidasa (PAP).
• Complejos avidina-biotina (ABC).

Métodos basados en la fosfatasa alcalina.

Procesamiento de Muestras (Prácticas)

1. Cogemos las muestras de los portaobjetos.
2. Paso por alcoholes (imagen).
3. Inhibición de la peroxidasa endógena.
4. Permeabilización mediante calor en olla.
5. Anticuerpo mediante micropipetas.

Inmunocitoquímica con Oro Coloidal

Protocolo:

1. Preincubación (Bloqueo): 30 minutos en tampón Tris-Salino-BSA-Glicina. A los 30 minutos se escurren las rejillas sobre un clínex sin secarlas por completo. No se lavan, se depositan sobre las gotas del primer anticuerpo.
2. Incubación: Anticuerpo primario: 90 minutos a temperatura ambiente.
3. Lavar con tampón Tris-BSA solo por la cara de los cortes, con una pipeta Pasteur gota a gota. Se escurre sobre el clínex y se coloca sobre la gota del segundo anticuerpo.
4. Incubación con el anticuerpo secundario: 90 minutos a temperatura ambiente.
5. Lavar con tampón Tris-BSA solo por la cara de los cortes, una pipeta Pasteur gota a gota. Lavar con agua destilada de igual manera. Se escurre sobre el clínex.
6. Contraste con acetato de uranilo 10 minutos.
7. Lavar con agua destilada.
8. Dejar secar y guardar.

Ventajas:

• No necesita revelado.
• Es más cuantificable.
• No existe oro coloidal endógeno.
• Permite marcajes múltiples.

Inconvenientes:

• Problemas de penetración.
• Agregados de Ig asociados al oro coloidal.

Controles en Inmunocitoquímica

• Control positivo.
• Control negativo.
• Controles de especificidad:
  • Saturación del anticuerpo primario.
  • Western blot.
  • ELISA.

Fraccionamiento Celular

Técnica bioquímica utilizada para separar los distintos orgánulos y componentes celulares: Homogeneización para conseguir una membrana.

Western Blot (Control de la Especificidad del Anticuerpo)

Inmunomarcaje: La membrana se incuba con un anticuerpo primario específico frente a la proteína que se quiere localizar. Se encuentra solo en algunas zonas.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

1. Antígeno que se pega al fondo de una placa de plástico.
2. Proteína bloqueante que cubre el plástico libre sin recubrir por el antígeno.
3. Anticuerpo marcado con una enzima (puntos verdes).

Micromatrices: Herramientas de Alto Rendimiento

Una Micromatriz o Microarray es una herramienta de laboratorio que se usa para analizar un número grande de genes, proteínas o fragmentos de tejido a la vez. En una micromatriz, las muestras biológicas se distribuyen sobre una superficie parecida a un portaobjetos de vidrio. Se agregan otras sustancias a estos portaobjetos para detectar estructuras específicas de las moléculas. Las micromatrices se están utilizando para ayudar a diagnosticar enfermedades como el cáncer y formular tratamientos para ellas. Se caracterizan porque los puntos son muy pequeños, se distribuyen en un plano, se organizan en filas/columnas y tienen una unión específica.

Tipos de Micromatrices

• Micromatrices de ADN.
• Micromatrices de Anticuerpos: Resulta de la agrupación ordenada sobre un portaobjetos de cristal de centenares de anticuerpos, de modo que en cada punto (spot) de la agrupación solo existe un único tipo de anticuerpo pegado al portaobjetos.

Características de un Punto (Spot):

• Tamaño: 100 µm (0,1-200 µm).
• Impresión:
  • Micropunteado con aguja.
  • Micropunteado sin contacto.
  • Electrospray proximal o distal.
  • Microcontacto.
  • Fotolitografía.
• Inmovilización:
  • Adsorción (nitrocelulosa).
  • Enlace covalente.
  • Hidrogeles (agarosa, poliacrilamida).
  • Moléculas de separación y orientación.

Procedimiento de Micromatrices

• Realización del experimento: tratado y control.
• Marcaje fluorescente: Cy3 y Cy5.
• Eliminación del exceso de marcaje.
• Mezcla (1:1) control y tratado.
• Bloqueo de la micromatriz.
• Incubación con la mezcla control-tratado.
• Análisis: escaneo y normalización.

Cultivos Celulares: Propagación y Estudio in Vitro

Los cultivos celulares sirven principalmente para la propagación de células fuera del organismo de origen. Estas células pueden ser de origen vegetal o animal y los cultivos celulares van a producir clones.

Aplicaciones de los Cultivos Celulares:

• Investigación: Comprender fisiologías, toxicología, virología.
• Ingeniería de tejidos: Piel, hueso, cartílago, etc.
• Producción biológica: Anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas, vacunas virales, etc.

Ventajas de los Cultivos Celulares

• Un solo tipo bien definido de células en cada cultivo.
• Fácil de manipular, condiciones controladas.
• Establecimiento de líneas internacionales de fácil acceso.
• Alternativa al uso de animales (Sistema para estudiar principios fisiológicos y chequeo posterior en un número reducido de animales).
• Pueden obtenerse grandes cantidades de células.
• Permite trabajar en pequeña, media y gran escala.
• Las células pueden mantenerse congeladas por largos períodos de tiempo con mínima pérdida de viabilidad.

Desventajas de los Cultivos Celulares

• No son animales enteros (Las células no están organizadas en verdaderos tejidos, no hay interrelación con otros tejidos y el comportamiento es distinto a la organización tridimensional).
• El entorno es distinto.
• Las condiciones de crecimiento son distintas.
• Las conclusiones de los ensayos deben ser debidamente acotadas.

Equipamiento Básico para Cultivos Celulares

• Autoclave: Para evitar que el material se contamine y esterilizarlo.
• Incubador de CO₂: Donde se localizan las células para evitar la humedad.
• Tanque de nitrógeno líquido: Para simular condiciones ambientales de frío extremo y mantener las muestras que lo necesiten congeladas.
• Cabina de flujo laminar: Donde el aire sigue un ciclo y se filtra para conseguir que la zona de trabajo sea estéril. Se utilizan actualmente campanas verticales que contienen un filtro HEPA (filtra un 99% de las partículas).
• Centrifugador: Para centrifugar células adherentes y en suspensión.
• Microscopio invertido: Para observar células vivas.
• Recipientes de cultivo: Placas Petri de distintos tamaños y observamos los frascos estáticos (células adherentes) y botellas rodantes (células en suspensión).

Tipos de Cultivo Celular

1) Cultivos Primarios

Es un cultivo de células, tejidos u órganos tomados directamente de un animal. Tomamos el animal en su forma necesaria, ya sea el huevo, la forma embrionaria o la forma adulta. La diseccionamos, aislamos el material y realizamos el cultivo.

• Cultivo de órganos (explantes): Mantenimiento de órganos o parte de órganos in vitro.
• Cultivo de tejido: Mantenimiento de tejidos in vitro.
• Cultivo de células: Mantenimiento de células dispersas.
  • Aislamiento.
  • Disección/disgregación.
  • Cultivo en recipiente.

2) Cultivos Secundarios

Subcultivos:

Cuando se tiene un cultivo primario, llega un momento en el que este cultivo entra en confluencia (se satura) porque ya no hay espacio ni nutrientes suficientes para todas las células. Para que las células puedan seguir creciendo, desarrollándose y alimentándose, se crean los subcultivos. Un subcultivo es un trasplante de un cultivo de células primarias a un medio de cultivo más grande o una distribución de estas a varios medios de cultivo. Los cultivos secundarios son aquellos cultivos de células que surgieron de un cultivo primario y que han sobrevivido a muchos subcultivos, hasta que llegan a una meseta tras la cual las células llegan a la senescencia (la muerte). A su trayectoria de crecimiento se le llama línea celular.

Líneas Celulares Estables:

Células mantenidas por subcultivos sucesivos comenzando por un cultivo primario.

• Ventajas: Control del entorno celular, homogeneidad celular, conocimiento del tipo celular y economía.
• Desventajas: Falta de diferenciación e inestabilidad de la línea (mutaciones de ADN).

Ej.: BHK: Fibroblastos de riñón de hámster sirio dorado, CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico.

Cultivos Continuos:

Células que han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Expectativa de vida infinita.

Medios de Cultivo

Sirven para tener medios de cultivo base, ya que tienen los nutrientes que necesitan las células (hidratos de carbono, lípidos, aminoácidos, etc.). Además, los medios de cultivo pueden contener aditivos como antibióticos, suero fetal (bovino), tampón pH, indicador pH y aditivos específicos (suplemento de glucosa). El indicador de pH es rojo fenol (color rosáceo 7,6 pH).

Propiedades Físico-Químicas del Medio:

• CO₂: 5%.
• pH: 7.0-7.7.
• Osmolaridad: 290-320 mOsm/kg.
• Viscosidad: suero.
• Temperatura: 37°C en mamíferos.

Subcultivos: Propagación de la línea celular y producción de células para la experimentación. Usualmente se realizan al llegar a confluencia. Evitan que el medio de cultivo se agote.

Fases del Cultivo Celular

• Fase de latencia: Tiempo que necesitan para fijarse al sustrato e iniciar el ciclo celular.
• Fase de crecimiento exponencial: El número de células se duplica cada 24h.
• Fase de confluencia: Aquellas células del cultivo que se han saturado dejan de dividirse.
• Fase de muerte: Si el cultivo se prolonga demasiado, las células entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.

Levantamiento y Conteo Celular

• Tripsinización.
• Levantamiento mecánico.

Separación Celular:

Para separar las células del medio, hay dos mecanismos que se emplean según el tipo de cultivo:

• Si el cultivo de células está en suspensión, entonces estas se podrán separar del medio por centrifugación, ya que las partículas más densas se precipitarán al fondo del recipiente.
• Si el cultivo de células está adherido al fondo, será necesario levantarlo. Para levantarlo, se puede llevar a cabo un proceso conocido como tripsinización en el que las enzimas digieren el adhesivo celular y estas pasan a estar en suspensión, con lo que se procedería al centrifugado. Aunque también existen técnicas de levantamiento mecánico.

Conteo Celular:

Las células se pueden contar a través de distintas maneras, pero la más utilizada es la de la cámara de Neubauer. Esta técnica consiste en una lámina de vidrio que tiene sobre ella una estructura con forma de H que la separa en dos subcámaras.

1. Cada una de estas subcámaras de la lámina de vidrio está separada en celdillas sobre las cuales se va a poner el medio de cultivo mezclado con algunas gotas de Tripán Azul para poder diferenciar las células al microscopio y poder contarlas.
2. Una vez que se haya metido el cultivo en estas cámaras, se pone un cubreobjetos sobre ella.
3. Para calcular el número total de células que hay en un cultivo se hace lo siguiente: Se cuentan las células que hay en cada celdilla de solo una de las subcámaras de la lámina de vidrio y se hace la media entre todas. El número resultante se multiplica por el factor de dilución y por 10⁴.

Objetivos y Experimentación en Cultivos Celulares

Objetivos:

• Investigación de un fenómeno biológico.
• Estudio de las bases moleculares de una patología.
• Investigación de los mecanismos empleados por los fármacos.
• Estudio de la toxicidad de determinados compuestos.
• Investigación de la estructura y función de macromoléculas y orgánulos celulares.

Experimentación:

• Planteamiento del problema.
• Cultivo celular (siempre con controles).
• Transfección (transitoria o estable):
  • Electroporación.
  • Fosfato cálcico.
  • Lipofección.
  • Microinyección.
• Observación de resultados.
• Cuantificación.

Prácticas de Laboratorio en Cultivos Celulares

Práctica 1: Tripsinizacion, Contaje y Siembra de Células PC-3

Objetivo: Sembrar diferentes concentraciones de células PC-3 en placas de 6 pocillos (p6) con cubreobjetos, para su posterior marcaje por inmunofluorescencia. La línea celular PC-3 es una línea celular humana, epitelial adherente, iniciada a partir de un adenocarcinoma prostático. A partir de un pocillo de p6 de células PC-3 en confluencia, se debe determinar la concentración de células viables/ml. Una vez conocida la concentración celular de partida, se debe determinar el volumen que se ha de sembrar en el resto de los pocillos de p6 con cubres (un pocillo por alumno), para depositar diferentes cantidades de células en cada pocillo.

1ª Parte: Tripsinizacion del Cultivo Celular PC-3.

• Placa de 6 pocillos (p6) con pocillo de células PC-3 confluentes por grupo.
• Retirar medio del pocillo con pipeta p1000.
• Lavar con 2 ml PBS atemperado (añadiéndolo cuidadosamente para evitar levantar la monocapa de células adheridas).

El lavado con PBS retirará los restos de medio y de iones Ca²⁺ que puedan inactivar la actividad de la Tripsina.

• Añadir 1 ml de Tripsina-EDTA atemperada, hasta cubrir toda la superficie del pocillo.
• Introducir la placa en incubador, dejar tripsinizar a 37°C 5 minutos.
• Inactivar la tripsina con 2 ml de medio RPMI atemperado.
• Homogeneizar la suspensión celular con pipeta p1000 y transferir el volumen total del pocillo a un Falcon 15.

2ª Parte: Contaje de Células Viables con Tripán Azul en Cámara Neubauer.

• Llevar 20 µl de la suspensión celular a un Eppendorf.
• Añadir otros 20 µl del colorante vital Tripán Azul. Homogeneizar la mezcla.
• Cargar 10 µl de la mezcla en cámara Neubauer.
• Contaje al microscopio.

El Tripán Azul es un colorante vital, que permite discernir entre células vivas (con membrana intacta, el colorante no penetra) y células muertas (membrana dañada, el colorante penetra, se ven azules al microscopio). Contar solo células vivas (brillantes sin color).

Contaje en Cámara Neubauer:

• Se deben contar los 4 cuadrantes (C) laterales y hacer la media.
• Dentro del cuadrante: cuadrícula de 4×4. Decidir en qué orden contar.
• Regla de la “L” para las células que se encuentren en los márgenes: decidir qué 2 de los 4 márgenes de la cuadrícula no contar.

FÓRMULA: Células/ml = (nº células C1 + nº células C2 + nº células C3 + nº células C4) / 4 × factor dilución × 10⁴.

3ª Parte: Siembra de Células en el Resto de Pocillos p6 Encima de Cubreobjetos.

• Determinar el volumen a sembrar de la solución de células totales para sembrar:
  • 200.000 células/pocillo (2 pocillos).
  • 100.000 células/pocillo (2 pocillos).
  • 50.000 células/pocillo (1 pocillo).
• Colocar un cubreobjetos en cada pocillo.
• Añadir el volumen de la suspensión celular necesario para cada siembra encima del cubreobjetos.
• Completar cada pocillo con medio RPMI hasta 3 ml. Homogeneizar bien.

4ª Parte: Fijación de Células con Paraformaldehído.

24 horas tras la siembra, una vez se han adherido las células PC-3 al sustrato y por tanto al cubreobjetos, se fijarán las células con paraformaldehído para su posterior tinción por inmunofluorescencia.

• Retirar cubres de los pocillos.
• Lavar cubres en PBS.
• Añadir 200 µl de Paraformaldehído al 4% en PBS sobre el cubreobjetos con células. Dejar actuar 15 min.
• Depositar los cubres en los pocillos sumergidos en 2ml de PBS.

Una vez fijados con PFA pueden mantenerse durante semanas a 4°C.

Práctica 2: Permeabilización, Tinción con DAPI y Faloidina, Montaje y Visualización al Microscopio de Fluorescencia.

Objetivo: Teñir con marcaje fluorescente el núcleo (DAPI) y el citoesqueleto (Faloidina) de células PC-3 previamente sembradas en cubreobjetos.

• El DAPI es un tinte fluorescente que se une fuertemente a regiones ricas en adenina y timina del ADN. Se usa frecuentemente en microscopía de fluorescencia para observar los núcleos celulares.
• La Faloidina es un tóxico extraído de la seta Amanita phalloides, capaz de unirse con alta afinidad al citoesqueleto, en particular a los filamentos de actina, evitando su despolimerización. En este caso, al estar conjugada con la proteína fluorescente verde (GFP) nos permitirá visualizar el citoesqueleto celular mediante fluorescencia.

1ª Parte: Permeabilización Celular.

• Cada grupo recoge su placa de 6 pocillos con 5 pocillos con cubres sembrados con células PC-3 en la práctica anterior.
• Las células ya han sido fijadas previamente y se encuentran sumergidas en PBS.
• Recoger con pinzas los cubres de los pocillos, secar el exceso de PBS, y depositarlos boca arriba en la “cámara húmeda”.
• Añadir gota a gota encima de cada cubre 200 µl de Tritón 0,1% en PBS. El cubreobjetos debe estar totalmente cubierto por Tritón 0,1%.
• Dejar incubar 15 minutos a temperatura ambiente.

2ª Parte: Tinción con Faloidina.

• Rellenar los pocillos con 2 ml de PBS nuevo.
• Lavar los cubres, para quitar el exceso de Tritón. Recoger los cubres con pinzas y sumergirlos boca arriba en los pocillos con PBS.
• Recoger con pinzas los cubres de los pocillos, secar el exceso de PBS, y depositarlos boca arriba en la “cámara húmeda”.
• Añadir gota a gota encima de cada cubre 200 µl de Faloidina (0,25 µg/ml). El cubreobjetos debe estar totalmente cubierto por la Faloidina.
• Dejar incubar 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad.

3ª Parte: Tinción con DAPI.

• Rellenar los pocillos con 2 ml de PBS nuevo.
• Lavar los cubres, para quitar el exceso de Faloidina. Recoger los cubres con pinzas y sumergirlos boca arriba en los pocillos con PBS.
• Recoger con pinzas los cubres de los pocillos, secar el exceso de PBS, y depositarlos boca arriba en la “cámara húmeda”.
• Añadir gota a gota encima de cada cubre 200 µl de DAPI (1 µg/ml). El cubreobjetos debe estar totalmente cubierto por el DAPI.
• Dejar incubar 15 minutos a temperatura ambiente en oscuridad.

4ª Parte: Montaje.

• Rellenar los pocillos de 6 well con 2 ml de PBS nuevo.
• Lavar los cubres, para quitar el exceso de DAPI. Recoger los cubres con pinzas y sumergirlos boca arriba en los pocillos p6 con PBS.
• Recoger con pinzas los cubres de los pocillos, secar el exceso de PBS, y depositarlos boca arriba en la “cámara húmeda”.
• Añadir dos gotas de medio de montaje en el centro de un portaobjetos previamente rotulado.
• Depositar el cubreobjetos boca abajo encima de la gota de medio de montaje. Apretarlo suavemente para eliminar las burbujas.
• Secar cuidadosamente los bordes del cubreobjetos para retirar el exceso de medio de montaje.
• Sellar con esmalte los bordes del cubreobjetos.
• Dejar secar y observar al microscopio de fluorescencia.

Seminarios de Biología Celular y Molecular

Seminario 1: Fluorescencia en Biología Celular

Fundamentos de la Fluorescencia

La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es expuesta a radiaciones UV, rayos catódicos o rayos X. Las radiaciones absorbidas (invisibles al ojo humano) son transformadas en luz visible (hν). Por ello, las moléculas a estudiar son marcadas con fluorocromos mediante una reacción química simple, permitiendo una detección simple y cuantitativa de la molécula. En Biología Celular, son diversas las aplicaciones: microscopía de fluorescencia, microscopía confocal, citometría de flujo, hibridación in situ, PCR en tiempo real y, sobre todo, en técnicas inmunoquímicas (consisten en la detección y localización de antígenos mediante anticuerpos específicos; se basan en la unión específica Ag-Ac). Para ello, se localiza una proteína a estudiar y se inyecta en el animal del que se extraerán los anticuerpos. Después, se extrae sangre de este y se centrifuga con el fin de separar el plasma sanguíneo con los anticuerpos producidos como respuesta. Estos anticuerpos se mezclan con la proteína extraída y el fluorocromo, con el fin de marcar el complejo Ag-Ac. Esto se puede hacer con varias proteínas y Ac (doble marcaje).

• Antígeno: Sustancia extraña que entra un organismo pluricelular. Conlleva la producción de anticuerpos como respuesta.
• Los anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas son glucoproteínas presentes en el suero producidas por los linfocitos B en respuesta a una estimulación antigénica.
• Especificidad: Capacidad de un Ac de reconocer su Ag y no otro.
• Afinidad: Fuerza o intensidad de unión.

Microscopía de Fluorescencia

La Microscopía de Fluorescencia es lograda marcando el Ac con un fluorocromo y permitiendo que este encuentre su Ag correspondiente presente en la muestra. Al marcar varios Ac con diferentes fluorocromos, se puede lograr la visualización de múltiples objetivos dentro de una misma imagen (doble marcaje). El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio óptico en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda, lo que requiere de filtros apropiados bajo el condensador y sobre el objetivo para dejar pasar la emisión secundaria deseada. Dependiendo del fluorocromo empleado, se requiere un color diferente (≠λ), lo que se logra con filtros de excitación. La luz de la fuente pasa por este y se descompone, choca con el espejo dicromático y se dirige a la muestra, que se excita y emite una radiación como respuesta. Esta respuesta asciende al ocular pasando por el filtro de emisión. Esto tiene un inconveniente: solo puede usarse un filtro al mismo tiempo, por lo que para crear una imagen con varios elementos marcados en diferentes colores, se deben hacer varias fotos y superponerse con un programa de edición fotográfica.

Fluorescencia con el Microscopio Confocal

Para este microscopio, se emplea una técnica óptica para incrementar el contraste de la imagen y/o reconstruir imágenes en 3D empleando elementos para eliminar luz desenfocada o destellos de la lente. Este microscopio, además, permite marcar diferentes elementos con distintos colores en la misma imagen. Su fuente de iluminación es un rayo láser y, por ello, posee un diafragma especial llamado pinhole que dirige el haz de luz. Para emplearlo, se deben seguir 3 pasos:

• Selección de la excitación: Se seleccionan diferentes λ para poder excitar un amplio número de marcadores fluorescentes.
• Selección de la proporción excitación-emisión: El “espejo ideal” debe reflejar la luz de la excitación totalmente y no reflejar en absoluto la luz de emisión de la fluorescencia, sino transmitirla.
• Selección de la emisión: El microscopio confocal suele tener más de un detector para poder registrar y visualizar simultáneamente diversos marcadores fluorescentes presentes en la muestra. Se pueden seleccionar las longitudes de onda específicas de la señal de fluorescencia y dirigirlas por separado a cada detector, formando entre 20 y 30 secciones. Se superponen imágenes y se obtiene una mayor resolución e imágenes tridimensionales.

Preparación de Muestras para Fluorescencia

Primero de todo, se deben emplear muestras criofijadas (corte de entre 5 y 10 µm). Se corta el tejido con un criótomos con el grosor anterior y después se congela (entre -20°C y -30°C). Después, se realiza una fijación rápida con paraformaldehído (2%-4%) para evitar que se pierda.

• Permeabilización: Se permeabiliza la muestra para que puedan difundir bien los Ac. Esto se realiza con detergentes biológicos (SDS, saponina…).
• Bloqueo de los Lugares Específicos a los que se Podría Unir el Ac: Se bloquean todos los lugares a los que se puede unir el Ac, por lo que debe ser lo suficientemente específico como para unirse al Ag específico. Se usa la albúmina del suero bovino (BSA) o suero del animal objeto de estudio.
• Marcaje: Se marca el Ac con fluorocromos. El marcaje puede ser directo o indirecto.
  • Directo: El Ac se une con el marcador (sustancia fluorescente).
  • Indirecto: El Ac se une a otro Ac, el cual se une a una sustancia fluorescente y, sobre este, una sustancia marcadora que precipite.
• Montaje: Se pone el cubreobjetos sobre la muestra. A veces, se pone la muestra directamente en el cubreobjetos (ya que ocupa menos que el portaobjetos). Se debe tener en cuenta al pegarlos:
  • Debe tener un medio acuoso.
  • Debe tener un pH adecuado al Ac y a la sustancia fluorescente.
  • Debe ser antifading, es decir, que no se difunda la sustancia fluorescente.

Sondas Fluorescentes

Son determinantes la abundancia de la molécula a la que se unirá el fluorocromo y las características físicas de este:

• Espectros de excitación (láser) y absorción (filtros).
• Brillo: Cantidad de luz emitida en función de la luz absorbida. Determina el rendimiento del fluorocromo.
• Fotoestabilidad: Capacidad que tiene un fluorocromo de ser sometido a repetidos ciclos de excitación/emisión sin ser extinguida su fluorescencia. Determina el rendimiento del fluorocromo.

Se elige un fluorocromo u otro en función de las líneas láser disponibles en el microscopio, las especificaciones de los filtros de emisión, los máximos de excitación y emisión, la mayor eficacia cuántica posible (más brillante), la fotoestabilidad máxima y la separación espectral para el marcaje múltiple (se deben emplear fluorocromos que emitan luz a λ muy diferente para diferenciar bien los componentes con diferentes colores). Una vez se toman las imágenes, se superponen unas sobre otras y se reconstruyen imágenes en 3D (colocalización).

Técnicas Avanzadas de Fluorescencia

• Técnica de FRET: Se da una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (de ahí el nombre de la técnica). Utilizado para medir distancias entre moléculas (regla molecular). Estas distancias están entre 1 y 10 nm. Se ha empleado para analizar interacciones moleculares, cambios conformacionales de moléculas y procesos de ruptura proteolítica, entre otras cosas.
• Técnica de FRAP: Es una técnica microscópica donde los fluorocromos de una región seleccionada de la célula son blanqueados usando luz láser de alta intensidad. Se mide el tiempo que tarda una zona en recuperar la fluorescencia. Es una técnica de imagen usada en células vivas para estudiar la movilidad (difusión) de las moléculas fluorescentes. Es útil para realizar medidas cuantitativas de la difusión de una molécula; del ensamblaje/desensamblaje de complejos proteicos; intercambio de proteínas citosólicas con diferentes orgánulos, etc.
• Técnica de FLIP: Se mide la pérdida de fluorescencia en otra zona de la célula diferente a aquella donde tiene lugar la fotodestrucción, valorándose cómo va difundiendo el fluorocromo destruido. Permite determinar si el tratamiento realizado implica disminución de la recuperación de la fluorescencia, es decir, una disfunción en el reciclado de la proteína. Se emplea para estudiar la conectividad/continuidad de membranas o compartimentos subcelulares (tráfico de vesículas a la membrana: membrana nuclear → RE → vesículas → aparato de Golgi…).

Microscopía en Células Vivas

Permite analizar procesos fisiológicos de forma dinámica, dando información tanto de la localización espacial en células y tejidos como de la temporalidad en la que ocurren dichos procesos. Se deben controlar las condiciones ambientales ([CO₂], pH, T…). Asimismo, se debe establecer un control sobre la fototoxicidad: tras sucesivos escaneos, se liberan radicales libres de oxígeno que se acumulan y son tóxicos para las células a estudiar. También el medio de montaje debe tener una baja autofluorescencia y se deben evitar proteínas que puedan estar presentes en el suero. Por último, se debe tener en cuenta que, si la excitación de la fluorescencia es baja y los procesos son largos, deben realizarse múltiples escaneos.

Citometría de Flujo

Las observaciones en cuestión se realizan a través de un citómetro de flujo, lo que implica medir las características de dispersión y difracción de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo de luz. Para esto, las células deben estar vivas e individualizadas (completamente separadas entre sí) en suspensión. Al atravesar el rayo de luz, las células interaccionan con este causando dispersión de la luz. Basándose en la difracción de la luz frontal, se puede evaluar el tamaño de la población celular que pasa y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se evalúa la granularidad o complejidad de estas. Además de la dispersión de la luz, si previamente se coloca a las células en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se pueden evaluar qué células poseen los antígenos complementarios a los Ac monoclonales usados.

Esto se puede emplear para estudiar la reacción de células tumorales ante un determinado medicamento. Como se observan las poblaciones de células, se puede observar si hay células que han muerto por necrosis o por apoptosis y la fase del ciclo celular en que lo han hecho. También se puede emplear para conocer si las células están expresando ciertas sustancias (hasta 4 a la vez) y la fase del ciclo celular en que lo hacen.

Seminario 2: Hibridación in Situ

Fundamentos de la Hibridación in Situ

La hibridación in situ es una técnica que permite localizar secuencias de ácidos nucleicos en estructuras anatómicas concretas. Se trata de observar la localización de ADN o ARN en una muestra mediante la hibridación de una sonda de nucleótidos complementaria a la secuencia que se está buscando. Por tanto, la hibridación se puede definir como una reacción mediante la cual se unen dos cadenas complementarias para formar un ácido nucleico de doble cadena. El fundamento es la complementariedad de bases nitrogenadas en los ácidos nucleicos (A-T, G-C). Se emplea para reconocer ácidos nucleicos en tejidos, extensiones celulares (cromosomas), células en cultivo, microscopía electrónica e incluso pequeños invertebrados (organismo completo, “wholemount”).

Algunas de las técnicas relacionadas con la hibridación in situ son:

• Northern blot: Reconocimiento de ARN en una membrana tras la transferencia de un gel.
• Southern blot: Reconocimiento de ADN en una membrana tras la transferencia de un gel.
• FISH: Reconocimiento de la posición de un gen en cromosomas.

En la hibridación in situ, se puede proceder desde el punto de vista de varias disciplinas. Desde el punto de vista de la biología molecular, se generan sondas (disoluciones con el fragmento problema). Estas sondas pueden ser de ARN (ribosondas) o de ADN (oligonucleótidos, fragmentos entre 20-25 nucleótidos; sonda oligonucleótida). Sin embargo, desde el punto de vista de la biología celular y tisular, se procede de la siguiente manera: preparación y fijación de tejidos, permeabilización, neutralización, hibridación, revelado y visualización, e interpretación y valoración.

Preparación para Hibridación en Biología Celular

Primero de todo, se debe realizar el autoclavado del material a utilizar (sobre todo si se quiere trabajar con ARN). Para ello, se debe tratar con DEPC (dietilpirocarbonato) para evitar su contaminación con RNAsas.

Hibridación en Biología Celular: Primero de todo, se debe desnaturalizar el ADN presente en ambas disoluciones. Después, ambas se mezclan y se enfría hasta un punto que permita a las dos hebras unirse. Una vez se da esto, existirán dobles hélices del ADN de la primera disolución, de la segunda disolución y dobles hélices híbridas. De este modo, se genera una sonda determinada, que se hibrida con el ADN circular de una bacteria que sea capaz de reproducirse exponencialmente en un tiempo corto, con el fin de obtener más copias de esa sonda. Después, se corta la secuencia (marcada con algún marcador determinado) de cada bacteria multiplicada con enzimas de restricción y entra en juego la biología celular.

Hibridación in Situ en Biología Celular

Preparación: Se trabaja, mayormente, con tejidos congelados para una mayor preservación de la estructura del ácido nucleico de interés. Se pueden emplear cortes de hasta 20 µm (cortados con criostato). También se pueden usar bloques de parafina, pero no es lo óptimo debido a lo anterior (desnaturalización). Después, se fija la muestra con paraformaldehído con el fin de conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado in vivo, aumentando su dureza y consistencia. El paraformaldehído interacciona con los grupos -NH₂ de las proteínas, formando enlaces transversales y conservando la estructura celular. La Permeabilización de la muestra se realiza con detergentes biológicos (Tritón, SDS), que además desnaturalizan las proteínas (dificultan el trabajo). Las proteínas desnaturalizadas se digieren con la enzima proteinasa K, que además inactiva nucleasas (las cuales degradan ácidos nucleicos). Consiste en Neutralizar el exceso de cargas positivas con una solución tampón (acetilación con 0.25 % anhídrido acético en trietanolamina).

Hibridación: La sonda y el tejido son puestos en contacto. La sonda está disuelta en formamida. Se deben tener en cuenta varios factores:

• Concentración de sales: NaCl en el solvente orgánico (formamida neutraliza el exceso de cargas positivas).
• Longitud de la sonda (20-25 nucleótidos).
• Contenido G/C (menos del 55-60%).
• Temperatura de desnaturalización, que se calcula como: TM = 81,5 + 16,6 log Msalt + 0,41% G-C − 500 / nº nucleótidos.

Para la hibridación, se emplea un hibridador (izq.), formado por placas calentadoras con unos soportes donde se colocan las muestras. Como es programable, se programa para aumentar 1°C cada 5 minutos (ya que los cambios de temperatura deben ser progresivos) hasta la temperatura calculada con la fórmula (que se mantiene durante 1h, p.ej.). En la parte superior, posee una cámara húmeda para evitar la desecación de los cortes (se debe rociar agua por los bordes). Cuando termina su trabajo, se fija una temperatura ambiente a la que permanecerá la muestra el tiempo necesario. Después de la hibridación, se debe Lavar la muestra con agua destilada (a tener en cuenta la concentración de Na⁺ y la temperatura). Para el Revelado se emplean marcadores. Estos marcadores pueden ser no radioactivos (biotina, digoxigenina y sustancias fluorescentes como la fluoresceína) o radioactivos (³⁵S, ³³P, ³²P…).

Los Marcadores Radioactivos tienen la ventaja de ser muy sensibles, pero son muy peligrosos cuando existen unos determinados tiempos de exposición a ellos. Con marcadores radiactivos se deben tomar ciertas precauciones. Deben meterse en una caja negra protectora durante 1 semana – 30 días. Pasado este tiempo, se abre la caja y se revela la muestra sobre una película fotográfica (todo ello, en un cuarto oscuro para evitar que la luz queme la película). La muestra estará representada en una escala de grises. Esto es un proceso muy lento, ya que tarda muchísimo más que la propia hibridación.

Marcadores No Radiactivos: Para estos marcadores, no es necesario tomar tantas precauciones. Pueden ser de digoxigenina (para la inmunodetección) o biotina, en ambos casos para un revelado a color; o fluoresceína, para un revelado fluorescente (microscopio de fluorescencia o confocal). Para el revelado fluorescente, se puede hacer un doble marcaje con dos sondas fluorescentes diferentes.

Controles en Hibridación in Situ

Una vez se termina la técnica, se comprueba que los resultados son correctos mediante controles. Pueden ser:

• Positivos: Con Northern blot o Southern blot, usando un tejido de positividad conocida o el solapamiento de resultados con inmunohistoquímica. Para esto último se superponen dos muestras duplicadas y se ven todas las células que expresan esa proteína.
• Negativos: Se hace un tratamiento previo con RNAsas, hay una omisión de la sonda y se utiliza una sonda sentido (sense). Se utiliza una sonda cuyo RNA no se expresa en esa muestra. La sonda antisentido indica dónde se une y dónde no.

Otras Técnicas de Hibridación

Técnica Southern:

Consiste en localizar genes o secuencias específicas en una población de fragmentos de ADN:

1. Homogeneización del tejido: Separación de los núcleos por centrifugación.
2. Lisado de los núcleos (liberar su contenido) con detergentes biológicos (SDS).
3. Desnaturalización y precipitación de las proteínas con fenol-cloroformo.
4. Precipitación de los ácidos nucleicos con etanol frío.
5. Eliminar el ácido nucleico que no interesa (ARN) mediante una enzima específica (RNAsa).
6. Fraccionamiento del ADN mediante enzimas de restricción.
7. Separación de los fragmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa y transferencia a membranas de nylon o nitrocelulosa. El ADN se desnaturaliza durante la transferencia.
8. Incubación del ADN con la sonda de ADN marcada e hibridación (calor + frío).
9. Detección de la sonda marcada para identificar el ADN hibridado mediante una placa autorradiográfica. Pueden ser sondas específicas (a) o no específicas (b).

Técnica Northern:

Consiste en localizar secuencias específicas en una población de fragmentos de ARN, por lo que el paso 5 varía (Eliminar el ácido nucleico que no interesa (ADN) mediante una enzima específica (ADNasa)) pero el resto de la técnica es igual.

Hibridación in Situ Fluorescente (FISH):

Es un proceso que detecta cromosomas o porciones de ellos, por lo que es útil para identificar anomalías cromosómicas y elaborar mapas génicos (cariotipo). Para ello, se emplean sondas específicas que se unen a regiones determinadas de los cromosomas, sondas que se encuentran marcadas con fluorocromos y los núcleos de las células con las que se trabajan deben estar en interfase o en metafase. La técnica consiste en extender la muestra en portaobjetos (núcleos interfásicos o metafásicos), agregar una solución desnaturalizadora de ADN, agregar solución de sonda ya desnaturalizada e incubar y, por último, observar la muestra al microscopio de fluorescencia (microscopio confocal) con los filtros correspondientes, para lo cual se realiza una contrastación. Desde su desarrollo, el FISH ha tenido gran evolución, con el fin de ser más eficiente en la detección de las alteraciones. En la actualidad, se cuenta con el SKY o cariotipo espectral que colorea diferentemente cada par de cromosomas homólogos, siendo muy útil en el estudio de cariotipos complejos.

Seminario 3: CRISPR/Cas9 – Edición Genómica

Desarrollo Histórico de CRISPR/Cas9

La investigación que condujo a CRISPR/Cas9 incluye descubrimientos sobre ADN recombinante, ratones transgénicos, y el trabajo de Rosalind Franklin sobre la estructura del ADN. Francis Mojica descubrió secuencias repetidas en Haloferax mediterranei en 1993, acuñando el término CRISPR en 2001. Antes de CRISPR, se menciona el «Gene Targeting» como un método anterior a CRISPR, limitado en especies y frecuencia, requiriendo mucho tiempo para obtener quimeras.

Componentes del Sistema CRISPR/Cas9

El sistema CRISPR/Cas9 requiere de un ARN guía (crRNA) que dirige la enzima Cas9 para generar roturas de doble cadena (DSB) en el ADN. En 2013, se desarrolló un sistema de edición CRISPR/Cas9 que utiliza un ARN guía único (sgRNA) y la nucleasa Cas9, que requiere un motivo PAM para funcionar.

Nuevas Proteínas Cas

Se mencionan diferentes proteínas Cas como SpCas9 (de Streptococcus pyogenes) y SaCas9 (de Staphylococcus aureus), cada una con diferentes tamaños, especificidades PAM y tipos de extremos que dejan tras el corte. También se menciona Cas12a (Cpf1).

Variantes y Aplicaciones de CRISPR/Cas9

Se discuten variantes como Dead Cas9 (Cas9 sin actividad nucleasa) y aplicaciones en terapia génica, incluyendo el uso de nanopartículas lipídicas, bacteriófagos Cas3, trasplantes autólogos y alotrasplantes de células madre modificadas, así como células CAR-T.

Edición de ARN con CRISPR

La edición de ARN tiene actividad colateral inespecífica y puede utilizarse para gene knockdown, terapia antiviral y detección de ARN viral como el del SARS-CoV-2.

Preocupaciones y Desafíos de CRISPR/Cas9

Se mencionan los «off-targets» y el problema de las roturas de doble cadena (DSB), que pueden llevar a mutagénesis.

Funcionamiento y Componentes Clave de CRISPR/Cas9 (Reiteración y Detalle)

CRISPR/Cas9 es una tecnología de edición genómica que ha revolucionado la biología molecular. ¿Qué es? CRISPR/Cas9 es una nueva nucleasa para la edición genómica. El sistema CRISPR/Cas9 requiere un ARN guía (crRNA) que dirige la enzima Cas9 para generar roturas de doble cadena (DSB) en el ADN. En 2013, se desarrolló un sistema de edición CRISPR/Cas9 que utiliza un ARN guía único (sgRNA) y la nucleasa Cas9, que requiere un motivo PAM para funcionar.

Componentes Clave:

• crRNA (ARN guía): Dirige a la proteína Cas9 al lugar específico del genoma donde se realizará la edición.
• Cas9 (nucleasa): Es una enzima que corta el ADN en el sitio indicado por el crRNA, generando una rotura de doble cadena (DSB).
• sgRNA (ARN guía único): En desarrollos posteriores, el crRNA se simplificó a un ARN guía único.
• Motivo PAM: Es una secuencia corta de ADN adyacente al sitio de corte que es necesaria para que Cas9 pueda unirse y cortar el ADN. Por ejemplo, SpCas9 (de Streptococcus pyogenes) reconoce el motivo PAM «NGG».

¿Cómo funciona? El sistema CRISPR/Cas9 funciona mediante la creación de cortes dirigidos en el genoma (DSB). La guía de ARN lleva la enzima Cas9 al gen diana, donde Cas9 realiza un corte de doble cadena.

Variantes de Proteínas Cas:

Existen diferentes proteínas Cas, cada una con especificidades y tamaños distintos. Por ejemplo, SpCas9 (de Streptococcus pyogenes) tiene un tamaño de 163 kDa y requiere un PAM de «NGG», mientras que SaCas9 (de Staphylococcus aureus) tiene un tamaño de 130 kDa y requiere un PAM de «NNGRR(T)». Cas12a (Cpf1) es otra variante que tiene un tamaño entre 145-185 kDa y requiere un PAM de «TTTV».

Aplicaciones:

El sistema CRISPR/Cas9 tiene diversas aplicaciones, incluyendo la terapia génica. Se utiliza en diferentes formatos como nanopartículas lipídicas (in vivo), bacteriófagos Cas3 (in situ en vejiga), trasplante autólogo (ex vivo), células CAR-T autólogas (ex vivo), y alotrasplante de células madre modificadas (ex vivo).

Limitaciones y Desafíos:

Uno de los problemas asociados con CRISPR/Cas9 son los «off-targets», que se refieren a cortes no deseados en otras partes del genoma, lo que puede llevar a mutagénesis.