Cuestionario de Biología Molecular: Hibridación y PCR

Contesta las siguientes preguntas y razona la respuesta:

1. Entre dos moléculas de ADN con la misma composición de bases, una con una longitud de 100 pb y otra con una longitud de 200 pb, ¿cuál tendrá mayor punto de fusión (Tm)?
   Al tener las dos moléculas la misma composición de bases y una longitud inferior a 500 pb, solo influye en la Tm la longitud. Por lo tanto, la molécula de 200 pb tendrá mayor Tm.
2. Entre dos moléculas de ADN con una longitud de 5000 pb, una con un 30% de AT y 70% de GC y otra con un 45% de AT y 55% de GC, ¿cuál tendrá menor punto de fusión?
   Al tener las dos moléculas más de 500 pb, el parámetro que más influye en la Tm es la proporción de GC. Por lo tanto, la molécula con el 55% de GC tendrá menor Tm.
3. En un tubo tenemos una solución de una molécula de ADN con una concentración de 5 µM. En otro tubo tenemos una solución de la misma molécula de ADN con una concentración de 8 µM. Si usamos estos tubos para sendos experimentos de desnaturalización, aumentando la temperatura y midiendo la absorbancia a 260 nm, ¿en qué tubo obtendremos un valor de Tm mayor?
   Al ser la misma molécula en ambos casos, se obtendrá el mismo valor de Tm en los dos tubos, porque la Tm no depende de la concentración de la molécula de ADN en el tubo, sino de la composición de bases.

Factores que influyen en la Tm de un híbrido

Respecto de los factores que influyen en la Tm de un híbrido en solución, indica el efecto correcto:

• Si se aumenta la concentración de formamida en la solución, disminuye la Tm del híbrido.
• Si se aumenta la concentración de cationes monovalentes en la solución, aumenta la Tm del híbrido.
• Para una misma sonda, un híbrido con un porcentaje de mismatch del 10% tendrá una Tm menor que un híbrido con un porcentaje de mismatch del 5%.

Verdadero o Falso: Hibridación y Marcadores

Afirmaciones sobre hibridación

• a) La mayor eficiencia de hibridación se consigue a temperaturas entre Tm-16 °C y Tm-32 °C. Verdadero.
• b) La rigurosidad (stringency) de una técnica de hibridación se fija principalmente en los lavados de poshibridación. Verdadero.
• c) Para fijar condiciones de elevada rigurosidad se utilizan tampones con alta concentración salina y baja concentración de formamida. Falso.
• d) Los híbridos de sondas marcadas con fluorocromos se detectan mediante autorradiografía. Falso.

Marcadores moleculares

Para cada uno de los marcadores citados a continuación, indica el tipo de marcador y cómo detectarías un híbrido formado por una sonda marcada con él:

• Digoxigenina: Hapteno, método inmunohistoquímico.
• FITC: Fluorocromo, microscopio de fluorescencia.
• 32P: Isótopo radiactivo, autorradiografía.
• Cy3: Fluorocromo, microscopio de fluorescencia.
• Biotina: Hapteno, método inmunohistoquímico (estreptavidina marcada con enzima sustrato/cromógeno).

Técnicas de Blotting y CGH

Sobre Blotting

• El dot blot permite detectar secuencias específicas de ADN y ARN y además aporta información sobre el tamaño de la secuencia diana. Falso.
• El Southern blot se utiliza para detectar secuencias de ARN y el Northern blot para detectar secuencias de ADN. Falso.
• En el dot blot hay que desnaturalizar la muestra antes de aplicarla a la membrana. Verdadero.
• En las técnicas de hibridación sobre membrana, antes de la hibridación hay que anclar los ácidos nucleicos de la muestra a la membrana mediante calor o radiación UV (para membranas de nailon). Verdadero.
• En las técnicas de hibridación en membrana, esta se puede rehibridar varias veces, independientemente del marcador utilizado en las sondas. Falso.

Hibridación Genómica Comparada (CGH)

• En los estudios de CGH se compara el ADN de una muestra problema con un ADN de referencia. Verdadero.
• La CGH permite detectar todo tipo de anomalías genéticas, tanto estructurales (traslocaciones e inversiones), como cuantitativas (deleciones y duplicaciones). Falso. La CGH compara las secuencias de ADN presentes en la muestra problema con las secuencias presentes en el ADN de referencia y, por ello, solo permite detectar pérdidas o ganancias de material genético (anomalías cuantitativas). Las translocaciones o inversiones no pueden ser detectadas.
• Para su realización se marcan el ADN problema y el ADN de referencia con fluorocromos diferentes. Verdadero.
• La hibridación se puede realizar sobre cromosomas en metafase o sobre microarrays. Verdadero.

Variantes de PCR

Empareja cada tipo o variante de PCR con las enzimas o cebadores que se utilizan en ellas:

• PCR múltiple: Varias parejas de cebadores en la misma PCR.
• PCR de grandes fragmentos: ADN polimerasa sin actividad correctora más ADN polimerasa con actividad correctora.
• PCR anidada (nested-PCR): 2 cebadores externos y dos internos, en dos PCR consecutivas.
• Hot Start PCR: ADN polimerasa inactiva hasta que se alcanza la temperatura de desnaturalización por primera vez.
• RT-PCR: Transcriptasa inversa más ADN polimerasa termoestable.
• PCR de alta fidelidad: ADN polimerasa con actividad correctora.

PCR a Tiempo Real (qPCR)

1. Cuando se usan agentes intercalantes: La fluorescencia se mide al final de la fase de extensión de cada ciclo. La fluorescencia aumenta con el número de ciclos.
2. Cuando se utilizan sondas de hidrólisis o sondas TaqMan: La fluorescencia se mide al final de la fase de extensión de cada ciclo. La fluorescencia aumenta con el número de ciclos.
3. Cuando se utilizan balizas moleculares: La fluorescencia aumenta con el número de ciclos. Se excita el notificador y se mide la fluorescencia emitida por el notificador.
4. Cuando se utilizan sondas FRET: La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación de cada ciclo. Se excita el notificador y se mide la fluorescencia emitida por el quencher.

Afirmaciones sobre qPCR

1. En la qPCR el punto de corte (Cp) es el ciclo en el que se pasa de la zona de ruido a la zona de crecimiento exponencial en la curva de amplificación. Verdadero.
2. El Cp de una muestra es directamente proporcional a la concentración inicial de la molécula diana en la muestra. Falso. La relación es inversamente proporcional: a mayor concentración inicial, menor Cp.
3. En la curva de picos de fusión generada por un termociclador a tiempo real se observan tantos picos como productos amplificados con distintas Tm específicos y no específicos se hayan sintetizado durante la PCR. Falso. No se pueden realizar curvas de fusión con sondas de hidrólisis, ya que estas se degradan durante el proceso.