FUNDAMENTOS:Se basa en la separación de compuestos volátiles debido a su diferente distribución (o reparto) entre 2 fases: Fm: un gas inerte (He, N₂, H₂). Fe: un líquido no volátil o un sólido adsorbente recubierto en el interior de una columna.
Cada analito se distribuye continuamente entre la Fm (gas) y la Fe (recubrimiento int columna).El equilibrio depende de:
Volatilidad del compuesto (P de vapor, . De eb).
Interacciones químicas con la fase estacionaria (polaridad, fuerzas de Van der Waals, dipolo-dipolo,).
T de la columna (+ T→ + volatilidad → – Rt).
INSTRUMENTACIÓN BÁSICA

1. Sistema de gas portador:

Es la fm gaseosa (helio – mejor separación; nitrógeno – económico; hidrógeno – rápido). Debe ser muy altamente puro y de flujo estable, pero no gasta separación. Su función es transportar los analitos por la columna sin rx con ellos. Incluye: cilindro de gas, reguladores de P°, manguera y medidor de flujo (probado con burbuja).

2. Reguladores de P° y caudal:

Mantienen el flujo constante de gas. El flujo variable cambia tiempo de retención y puede arruinar la reproducibilidad.

3. Inyector o sistema de inyección:

Su función es introducir la muestra de forma reproducible y vaporizarla inmediatamente antes de entrar a la columna.Carácterísticas: Está a un T 50°C por encima del p.Eb del componente menos volátil, microinyección con jeringa. Al final del inyector hay 3 modos:

Split:

divide la muestra, solo ingresa una fracción; evita sobrecargar la columna → ideal para compuestos muy concentrados.

Splitless

Entra la muestra completa → mayor sensibilidad → se usa para trazas (ms) pero la muestra es muy diluida.

On-column:

inyección directa dentro de la columna → muestra termolábil (no se degrada).

4. Columna cromatográfica:
Donde ocurre la separación. Existen 2 tipos:

Empacadas:

tubos de 2–5 m y 2–4 mm de diámetro, llenos con un sólido recubierto de Fe líquida Capilar (WCOT):
15–60 m de largo, 0,15–0,53 mm de diámetro int. La pared interna recubierta con una película fina de Fe → eficiente, Rs ↑, largo, delgadas.

5.Horno:

La columna se aloja dentro de un horno con T controlada, la cual modula la volatibilidad de los compuestos. Funciones:Mantener una T estable (isotérmico) o realizar programación de temperatura (aumentarla gradualmente) para separar analitos con . De eb muy diferentes.

↑ temperatura → ↓ retención → picos más rápidos. ( Pasan más tiempo en la Fm) Es útil para compuestos pesados o de alto punto de ebullición, que si no, ni siquiera evaporan bien.Ej: Un hidrocarburo de 20 carbonos necesita más temperatura para poder salir.
↓ temperatura → ↑ retención → mejor separación para compuestos volátiles. Los analitos evaporan lento. Pasan más tiempo pegados/interactuando con la fase estacionaria.La separación entre compuestos puede mejorar (mayor resolución).

6. Detector (FID, TCD, ECD);

Transforman la salida química en una señal eléctrica.
FID (Flame Ionization Detector):Quema el efluente en una llama de H₂/aire. Detecta iones producidos por compuestos orgánicos.Muy sensible. Responde casi a todos los compuestos orgánicos (no a agua, CO₂, etc.).
TCD (Thermal Conductivity Detector):Mide cambios en la conductividad térmica del gas efluente. Universal, pero menos sensible. No es destructivo
ECD (Electrón Capture Detector):Muy sensible a halógenos, nitrocompuestos, pesticidas. Registra la salida de cada compuesto y genera el cromatograma.
MS (Espectrómetro de masas): identificación por estructura, lo más potente.

7 Sistema de adquisición de datos

Es el computador o módulo electrónico que:Registra la señal. Construye el cromatograma. Calcula tiempos de retención, áreas de picos y concentraciones..
——————–
✔️ Puede analizar:

Compuestos orgánicos volátiles (COV)

Hidrocarburos, alcoholes, cetonas, aromáticos, etc. Se vaporizan sin descomponerse.

Gases y compuestos ligeros:

Metano, etano, CO₂, O₂, N₂, gases licuados, etc.

Sustancias semivolátiles:

Ftalatos, pesticidas,(PAHs), alcanos pesados, etc. Pueden requerir derivatización para aumentar estabilidad o volatilidad.

Mezclas complejas de compuestos orgánicos:

Gasolina, aceites esenciales, perfumes, alientos, contaminantes ambientales.Gracias a columnas capilares y detectores como FID y MS.

Derivados químicos de compuestos menos volátiles:

A través de derivatización, por ejemplo:ácidos carboxílicos → derivados más volátiles. Azúcares → trimetilsililación (TMS)

CONDICIONES ÓPTIMAS DEL GC:
1️⃣ Gas portador (fase móvil Helio → el más usado: excelente eficiencia y compatible con todos los detectores.
Hidrógeno → aún más eficiente y rápido, pero requiere medidas de seguridad.✔️ Flujo óptimo:Depende Debe ser extremadamente puro (grado cromatográfico) para evitar ruido y daño al detector.

Temperatura

Debe ser lo suficientemente alta para vaporizar completamente la muestra, pero sin descomponerla.50–100 °C por encima del punto de ebullición del analito menos volátil. Inicio bajo para separar compuestos volátiles.Aumento gradual (rampa) para eluir los menos volátiles.

Inyector 50 °C sobre el p.Eb más alto → vaporización completa; Columna capilar WCOT con dimensiones estándar (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm); Fase estacionaria con polaridad semejante al analito.

VENTAJAS:1.

Alta eficiencia y resolución:

Las columnas capilares permiten separar compuestos muy similares con picos estrechos y definidos.

2. Excelente sensibilidad:

Detecta cantidades muy pequeñas (ng–pg), especialmente con detectores como FID, ECD y MS.

3. Rapidez de análisis:

Los tiempos de corrida suelen ser de segundos a minutos, lo que permite analizar muchas muestras al día.

4. Alta reproducibilidad:

Las condiciones controladas (temperatura, flujo, presión) permiten obtener resultados muy consistentes.

5.Excelente capacidad cuantitativa:

Las áreas de los picos son muy precisas, ideal para análisis cuantitativos.
DESVENTAJAS:

1. Solo sirve para compuestos volátiles y térmicamente estables 2. No apta para moléculas grandes o biológicas

Proteínas, ADN quedan fuera por su tamaño o inestabilidad térmica.

3. Requiere preparación:

A veces se necesita derivatización para hacer volátiles a compuestos polares o termolábiles, lo que agrega tiempo y complejidad.
4. Muestras acuosas generan problemas:El agua puede dañar la fase estacionaria, afectar detectores y dar mala forma en los picos.
FUNDAMENTO:Separa compuestos porque cada analito se reparte de manera distinta entre una Fm líquida a alta P y una Fe sólida dentro de la columna. Mientras avanzan, los compuestos se adsorben y desorben repetidamente según su polaridad, hidrofobicidad, carga e interacciones químicas, lo que produce tR =.
Este reparto diferencial es el HPLC

INSTRUMENTACIÓN BÁSICA DE HPLC

1. Reservorios de fase móvil:

Contienen los solventes (agua, buffer, metanol, acetonitrilo) que actuarán como fm líquida. Deben ser de alta pureza, filtrados y desgasificados porque cualquier burbuja afecta la línea base y la P. Permiten trabajar en modo isocrático (composición fija) o gradiente (cambio de composición durante el análisis).

2. Desgasificador:

Su función es eliminar el aire disuelto en la fase móvil para evitar pulsos en la P, ruido en el detector y formación de burbujas en la bomba. Puede operar por vacío, membrana o ultrasonido. Es crítico cuando se trabaja con detectores muy sensibles como UV o DAD.

3. Bomba de alta presión:

Genera el flujo constante y preciso de la fm y es capaz de trabajar entre 1000 y 6000 psi. Mantiene la estabilidad del sistema y permite realizar gradientes de composición sin generar variaciones bruscas. Un flujo inestable afecta directamente el tiempo de Rs y rep

4. Inyector o sistema de inyección:

Introduce la muestra en un v pequeño y reproducible (5–100 µL) sin interrumpir el flujo de la Fm. Puede ser una válvula manual de seis puertos o un autosampler. La muestra entra a presión y se mezcla inmediatamente con la Fm para comenzar la separación.

5. Columna cromatográfica:

Es un tubo de acero inoxidable relleno con partículas de sílica de alta pureza modificadas químicamente (C18, C8, fenil, CN, intercambio iónico). Sus dimensionesson 150–250 mm de largo, 4,6 mm de diámetro y partículas de 3–5 µm. Aquí ocurre el equilibrio de reparto que determina el tiempo de Rs de cada compuesto.

6. Horno o compartimiento termostatado:

Mantiene la columna a una T controlada (25–60 °C). La T estable mejora la reproducibilidad y la forma de los picos. Algunos métodos usan programación de temperatura para optimizar la resolución en mezclas complejas.

7. Detector:

Registra la señal generada por cada analito al eluir de la columna. Los más usados son UV-Vis y DAD (absorbancia), pero también existen detectores de fluorescencia, índice de refracción (RID), electroquímicos y espectrometría de masas. 

8. Sistema de adquisición de datos:

Software que controla bomba, inyector, detector, registra el cromatograma y realiza integración, cálculo de áreas y tiempos de retención. Es esencial para análisis cuantitativos.

✔️ Puede analizar:no volátiles, termolábiles, polares o de alto peso molecular que no pueden ser analizados por cromatografía de gases. Es especialmente útil para separar y cuantificar fármacos, metabolitos, proteínas pequeñas, aminoácidos, azúcares, vitaminas, compuestos orgánicos polares, péptidos, fenoles, alcaloides, compuestos en matrices biológicas, así como componentes en alimentos, cosméticos y productos farmacéuticos. También permite analizar mezclas complejas mediante diferentes modos (fase reversa, normal, intercambio iónico, exclusión por tamaño), siendo ideal para compuestos que necesitan condiciones suaves, que se degradan con el calor o que requieren trabajar en un rango amplio de polaridades donde GC no es aplicable. 
CONDICIONES OPTIMAS
Incluyen usar una fase móvil pura y desgasificada, un flujo estable, una columna adecuada (generalmente C18) con temperatura controlada, y una muestra filtrada en solvente compatible. Además, ajustar el pH, la composición del eluyente y la longitud de onda del detector permite mejorar la resolución y la reproducibilidad. 
VENTAJAS:

Alta resolución:

Separa mezclas complejas con picos bien definidos.

. Analiza compuestos no volátiles:

Útil para moléculas polares, grandes o termolábiles que GC no puede analizar.

Control de variables:

Permite ajustar pH, composición del eluyente y temperatura para optimizar la separación.

Buena sensibilidad y cuantificación:

Detecta bajas concentraciones con precisión.

Gran versatilidad:

Diferentes modos (reversa, normal, iónica, SEC) para diversos tipos de analitos
DESVENTAJAS:

Costo elevado:

Equipos, columnas y mantenimiento son caros.

Alto consumo de solventes:

Usa grandes volúMenes de metanol/acetonitrilo y genera residuos.

Limitación de detectores:

Algunos detectores no son muy sensibles o solo sirven para ciertos compuestos.

Requiere preparación estricta de muestras:

Deben filtrarse y ser compatibles para evitar dañar la columna.

Análisis más lentos:

Generalmente toma más tiempo que GC, especialmente con gradientes.

FUNDAMENTO: La SFC utiliza un fluido supercrítico, normalmente CO₂, como fase móvil. Este fluido tiene baja viscosidad y alta capacidad de disolver compuestos, permitiendo que los analitos se separen según su diferente solubilidad en el CO₂ y su interacción con la fase estacionaria.
Ajustando presión y temperatura se modifica la densidad del fluido y, por lo tanto, la retención y la elución. Es una técnica rápida, eficiente y adecuada para compuestos no volátiles o termolábiles. 
INSTRUMENTACIÓN BÁSICA

1. Bomba para CO₂ supercrítico:

Genera y mantiene la presión necesaria para llevar el CO₂ a estado supercrítico. Debe entregar flujo estable porque la densidad del fluido depende directamente de la presión.

2. Bomba auxiliar de modificador:

Inyecta un solvente orgánico (metanol, etanol o isopropanol) que actúa como modificador para aumentar la polaridad de la fase móvil y mejorar la elución de analitos más polares.

3. Sistema de enfriamiento del CO₂:

Mantiene el CO₂ líquido a baja temperatura antes de la bomba para evitar cavitación y asegurar un flujo constante.

4. Inyector o válvula de inyección:

Introduce la muestra de manera reproducible bajo condiciones de alta presión. Puede ser manual o automático y debe resistir presiones más altas que en HPLC.

5. Columna cromatográfica:

Generalmente columnas similares a HPLC (C18, sílica, fenil, CN). En SFC la selectividad depende tanto de la fase estacionaria como de la densidad del fluido supercrítico.

6. Horno de columna:

Controla la temperatura (típicamente 30–60 °C), lo cual es crítico porque la temperatura afecta la densidad del CO₂ y, por lo tanto, la retención de los analitos.

7. Restrictor o válvula de back-pressure (BPR):

Mantiene la presión constante durante el análisis para asegurar que el CO₂ permanezca en estado supercrítico. Es uno de los componentes más importantes del SFC.

8. Detector:

Usualmente UV-Vis o DAD, pero también se puede acoplar a MS. El detector debe colocarse después del restrictor porque el CO₂ debe expandirse a presión atmosférica antes de ser detectado

✔️

Puede analizar:

Compuestos no polares y moderadamente polares:

Esteroides, terpenos, lípidos, carotenoides, triglicéridos.

Moléculas termolábiles:

Fármacos y compuestos naturales que se degradan con el calor y no pueden ir a GC.

Mezclas lipofílicas complejas:

Aceites esenciales, grasas, cosméticos y matrices ricas en lípidos.

Compuestos quirales:

Fármacos y agroquímicos enantioméricos usando columnas quirales.

Semivolátiles difíciles para GC:

Pesticidas, ftalatos, PAHs y aromáticos pesados sin necesidad de derivatización.

Oligómeros y polímeros pequeños:

PEGs y materiales de bajo peso molecular.
CONDICIONES ÓPTIMAS:

Fluido supercrítico adecuado:

Usar CO₂ de alta pureza; mantenerlo por encima de su Tc (31 °C) y Pc (73 atm) para asegurar estado supercrítico estable.

Presión constante mediante BPR:

Mantener una presión fija y suficiente (100–300 bar) para controlar la densidad del CO₂ y asegurar retención reproducible.

Temperatura controlada del horno:

Operar entre 30–60 °C para evitar variaciones en la densidad del fluido y mejorar la estabilidad de los tiempos de retención.

Uso de modificador orgánico:

Añadir 5–30% de metanol/etanol para aumentar polaridad y mejorar la elución de analitos más polares.
VENTAJAS:

Análisis rápidos:

El CO₂ supercrítico tiene baja viscosidad y permite tiempos de corrida mucho menores que HPLC.

Menor consumo de solventes:

Usa principalmente CO₂, reduciendo costos y residuos orgánicos.

Ideal para compuestos termolábiles:

Opera a temperaturas bajas, evitando descomposición que ocurre en GC.

Buena separación de compuestos no polares:

Excelente para lípidos, terpenos, esteroides y carotenoides.

Excelente para análisis quiral:

Suele dar mejor velocidad y resolución que HPLC quiral.
DESVENTAJAS:

Equipos más costosos:

Requiere bombas especiales, CO₂ supercrítico y sistemas de back-pressure.

Limitado para compuestos muy polares:

Algunos analitos requieren mucho modificador para eluir.

Menor disponibilidad de columnas:

Menos opciones que en HPLC, especialmente para analitos muy polares.

Técnica menos difundida:

No todos los laboratorios tienen equipos, soporte o métodos estandarizados.

Complejidad en control de presión:

La retención depende fuertemente de condiciones críticas de presión y temperatura.

⭐ 1. Fundamento de la Electroforesis Capilar (CE)

La electroforesis capilar separa analitos aplicando un campo eléctrico dentro de un capilar lleno de un electrolito. Cada molécula migra según su carga, tamaño y su movilidad electroforética, más el flujo electroosmótico del capilar. Las especies más cargadas y más pequeñas migran más rápido, mientras que las menos cargadas o más grandes avanzan más lento, generando diferencias de tiempo de migración que permiten la separación. Al trabajar en capilares estrechos, la técnica logra alta resolución, alta eficiencia y requiere volúMenes mínimos de muestra.

⭐ 2. Fundamento de la Electrocromatografía Capilar (CEC)

La CEC combina principios decromatografía líquida y electroforesis capilar. El capilar contiene una fase estacionaria (como en HPLC), pero el movimiento de la fase móvil no depende de una bomba sino del flujo electroosmótico generado por un campo eléctrico. Los analitos se separan por afinidad cromatográfica con la fase estacionaria (interacciones hidrofóbicas, polares, etc.) y simultáneamente por su movilidad electroforética. Esto permite separaciones muy eficientes, con picos estrechos y selectividad similar a HPLC pero con consumo mínimo de solventes.

⭐ 3. Fundamento del Fraccionamiento por Flujo en Campo (FFF)

El FFF separa partículas y macromoléculas aplicando uncampo externo (flujo, fuerza, campo eléctrico o térmico) perpendicular al flujo de la muestra en un canal estrecho. El campo fuerza a los analitos a distribuirse en distintas posiciones dentro del canal según su tamaño, masa, densidad o movilidad, y debido al perfil laminar del flujo, cada capa tiene velocidades de arrastre diferentes, lo que produce la separación. Las partículas más grandes o pesadas quedan más cerca de la pared (zona de flujo lento), mientras que las más pequeñas quedan en zonas de flujo rápido, eluyendo primero. Es ideal para proteínas, nanopartículas, polímeros, liposomas y agregados que no pueden analizarse por técnicas convencionales