Centrifugación: Principios, Equipamiento y Aplicaciones

1. Introducción a la Separación de Sólidos y Líquidos

El método más común para separar un sólido insoluble de un líquido es la filtración. Alternativamente, se puede emplear la decantación si el sólido se deposita fácilmente por gravedad en el fondo del recipiente (sedimentación) o si permanece en la superficie del líquido (flotación). La sedimentación o flotación de un sólido depende de su densidad relativa respecto a la del líquido.

En esencia, el sólido experimenta una fuerza ascendente debida al empuje que el líquido ejerce sobre él. La magnitud de esta fuerza es igual al peso del líquido desplazado por el sólido, según el principio de Arquímedes. El sólido sedimentará si esta fuerza es inferior al peso del sólido (fuerza de gravedad); de lo contrario, flotará.

Cuando las partículas son muy pequeñas, los procesos de sedimentación o flotación pueden ser extremadamente lentos. Esto se debe, por un lado, a la resistencia al avance de las partículas provocada por la fricción con el líquido y, por otro, a los movimientos aleatorios inducidos por las turbulencias térmicas (difusión). En estos casos, la centrifugación se convierte en la técnica de elección para su separación.

La centrifugación es una técnica de separación utilizada para aislar o concentrar partículas suspendidas en un líquido. Aprovecha la diferente velocidad de desplazamiento de las partículas, que varía según su forma, tamaño o peso, al ser sometidas a una fuerza centrífuga.

La fuerza centrífuga se ejerce sobre un cuerpo en movimiento circular y tiende a alejarlo del eje de rotación. Su magnitud es directamente proporcional a la masa del cuerpo, el radio de giro y la velocidad de giro (o angular). Esta fuerza puede acelerar la sedimentación de partículas que tienden a depositarse espontáneamente (densidad > líquido) o inducir la sedimentación en aquellas que tienden a flotar (densidad < líquido).

La fórmula para la fuerza centrífuga es: Fc = m · ac.

2. Instrumental para Centrifugación

Tubos

Los tubos de centrifugación están fabricados con materiales inertes que no interactúan con los componentes de la muestra y son resistentes a la deformación a altas velocidades. La elección del tubo depende del tipo de rotor, tipo de muestra, volumen y tipo de fraccionamiento. Pueden ser de vidrio (hasta 25.000 g) o de materiales poliméricos como polipropileno o policarbonatos.

Centrífugas

Existen diferentes tipos de centrífugas, clasificadas según su rango de velocidades de giro:

• A. Centrífugas de baja velocidad, de sobremesa o clínicas: Son de pequeño tamaño, generalmente sin refrigeración, y alcanzan velocidades máximas de 5.000 rpm. Son útiles para la separación de partículas grandes como células o precipitados de sales insolubles. Incorporan una tapa de seguridad que impide su apertura hasta que el rotor se ha detenido completamente. Las centrífugas micrófugas son una variante que alcanza más de 10.000 rpm con volúmenes de trabajo muy pequeños, siendo útiles en biología molecular. Las centrífugas de hematocrito son otra variante especializada.
• B. Centrífugas de alta velocidad: Alcanzan velocidades de entre 18.000 y 25.000 rpm. Suelen ser refrigeradas y algunas disponen de sistema de vacío para minimizar el calentamiento del rotor por rozamiento con el aire. Son adecuadas para la separación de fracciones celulares, pero insuficientes para aislar ribosomas, virus o macromoléculas.
• C. Ultracentrífugas: Superan las 50.000 rpm y requieren sistemas auxiliares de refrigeración y alto vacío. Existen ultracentrífugas analíticas, que permiten obtener datos precisos sobre propiedades de sedimentación (coeficientes de sedimentación, pesos moleculares), y preparativas, útiles para aislar partículas de bajo coeficiente de sedimentación (microsomas, virus, macromoléculas).

Rotor

El rotor es la pieza que gira impulsada por el motor y sobre la cual se coloca la muestra. Deben ser de materiales ligeros y resistentes a altas velocidades de giro, como titanio o fibra de carbono. Existen diferentes tipos de rotores:

• 1. Oscilantes, flotantes o basculantes: El adaptador del tubo está unido al brazo del rotor por su parte superior, pero no está fijo. Durante la centrifugación, los tubos se sitúan perpendiculares al eje de rotación. Se utilizan para separaciones más precisas, ya que la fuerza centrífuga actúa en la dirección de la longitud del tubo. Permiten separar partículas en función de su densidad utilizando gradientes de densidad.
• 2. De ángulo fijo: El adaptador del tubo tiene una cierta inclinación respecto al eje de giro. Se emplean para separaciones más sencillas (células, orgánulos celulares, membranas, proteínas agregadas) y, especialmente, en separaciones secuenciales a velocidades crecientes.
• 3. Verticales: Rotores macizos con compartimentos tallados paralelos al eje.

3. Modalidades de Centrifugación

Según el propósito:

• Centrifugación analítica: Su objetivo es medir propiedades físicas de las partículas que sedimentan, como el coeficiente de sedimentación o la masa molecular. La ultracentrifugación analítica es una variante destacada. Las moléculas se observan mediante un sistema óptico durante la centrifugación. Los tubos deben ser de cuarzo para permitir el paso de luz visible y ultravioleta. Se utiliza un rotor basculante para la observación en vertical.
• Centrifugación preparativa: Su objetivo es aislar partículas, células o moléculas para su posterior análisis o utilización.

Según el medio y la aplicación de la muestra:

• Centrifugación diferencial.
• Centrifugación mediante un gradiente de densidades:
  • Centrifugación zonal.
  • Centrifugación isopícnica o de equilibrio.

3.1. Centrifugación Diferencial

Es el método de separación más común, esencial en la purificación enzimática. En este método, el tubo de centrífuga se llena con la mezcla problema. Tras la centrifugación, se obtienen dos fracciones: un pellet (material sedimentado) y un sobrenadante (material no sedimentado). El método es inespecífico, y no se puede predecir a priori dónde se encontrará la partícula de interés.

El comportamiento de cada componente de la muestra depende de su forma, tamaño, densidad y de las condiciones de centrifugación. Es una técnica muy útil para el aislamiento de células y orgánulos subcelulares.

3.2. Centrifugación mediante Gradiente de Densidades

Este tipo de centrifugación permite que las partículas se distribuyan en fracciones de diferentes densidades de un fluido líquido. Aunque es un método más elaborado que la centrifugación diferencial, ofrece ventajas significativas. Permite la separación de varios componentes de la muestra y la realización de medidas analíticas.

El método implica el uso de un soporte fluido cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se forma con un soluto, preferiblemente de baja masa molecular, que no interfiera con la muestra. Se utilizan solutos como sacarosa, polisacáridos sintéticos, derivados yodados del ácido benzoico o sales de metales pesados (rubidio, cesio).

La muestra se deposita en la parte superior del gradiente como una fina banda. Tras la centrifugación, la separación de los componentes se manifiesta como diferentes bandas o zonas que pueden ser recolectadas (fraccionadas).

Existen dos tipos de gradientes: continuos y discontinuos.

Gradientes Continuos:

Los gradientes continuos pueden formarse a partir de gradientes discontinuos. Los límites entre capas desaparecen gradualmente por difusión de los solutos, linealizándose las discontinuidades hasta obtener una densidad uniforme. Una forma de crearlos es rotando cuidadosamente el tubo de una posición vertical a horizontal, lo que convierte un gradiente discontinuo en continuo en menos de una hora.

Gradientes Discontinuos:

El método más común para formar gradientes discontinuos consiste en colocar la solución más densa en el fondo y añadir capas sucesivas de menor densidad, evitando la mezcla y la oclusión de aire. Hay dos variantes principales de este método: la centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica.

3.2.1. Centrifugación Zonal:

En la centrifugación zonal, la muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidades previamente formado. Debido a la fuerza centrífuga, las partículas se mueven a velocidades que dependen de su masa y sedimentan en diferentes zonas del gradiente. La densidad máxima del gradiente no debe exceder la de las partículas a separar.

3.2.2. Centrifugación Isopícnica o de Equilibrio:

La centrifugación isopícnica separa las partículas en un gradiente de densidades en función de su propia densidad. Las partículas se mueven en el gradiente hasta alcanzar un punto donde su densidad es idéntica a la del gradiente (de ahí el nombre isopícnico). En este caso, es fundamental que la densidad máxima del gradiente final sea siempre superior a la densidad de las partículas. Por este motivo, la sedimentación final no se produce si se controlan las condiciones, ya que las partículas flotan sobre un «colchón» de material de densidad superior. Esta técnica se utiliza, por ejemplo, para separar partículas similares en tamaño pero de diferente densidad, como ácidos nucleicos o diferentes orgánulos celulares.

4. Procedimiento Básico de Centrifugación

1. Colocar el tubo de muestra (suspensión o disolución) en uno de los receptáculos del rotor.
2. Compensar el tubo de muestra colocando en el receptáculo diametralmente opuesto otro tubo con un volumen de líquido de peso idéntico al de la muestra.
3. Cerrar herméticamente el compartimento del rotor y poner en funcionamiento la centrífuga. Una vez finalizada la centrifugación (las centrífugas suelen tener un temporizador), esperar a que el rotor se detenga completamente antes de abrir la tapa y extraer los tubos.

5. Aspectos Prácticos de la Centrifugación

• La centrífuga debe estar sobre una base sólida y fija.
• El rotor debe ser compatible con la centrífuga y estar perfectamente fijado al motor.
• La distribución de los tubos en el rotor debe ser tal que este esté perfectamente equilibrado (compensado) para evitar vibraciones y posibles roturas. Si es necesario, se utilizan tubos adicionales con volúmenes de líquido de pesos idénticos a los de las muestras.
• Los tubos deben ser compatibles con la centrífuga para evitar roturas durante el funcionamiento.
• La tapa que aísla el rotor del exterior debe estar bien cerrada y asegurada.
• Nunca se debe dejar la centrífuga sin supervisión hasta que alcance la velocidad máxima de giro.

6. Cálculos en Centrifugación

La conversión de la velocidad de giro (revoluciones por minuto, rpm) a aceleración centrífuga (fuerza centrífuga relativa, FCR) es fundamental. Se conseguirá una misma separación en dos centrífugas distintas cuando sea igual su FCR, no si es igual la velocidad de giro. La relación entre ambas depende del radio del rotor (medido desde el eje de giro hasta la posición de la muestra).

La FCR se mide empleando como unidad la aceleración de la gravedad (g).

La fórmula para calcular la FCR es:

FCR = 11,19 · 10^-6 · V² · r = V² · r / 89.365 (g)

Donde:

• V = velocidad (rpm)
• r = radio (cm)

Ejemplo: Calcula el número de g alcanzado por un rotor de centrífuga de 5 cm de radio que gira a una velocidad de 10.000 rpm.

Respuesta: FCR = (10.000)² · 5 / 89.365 = 5.600 g.

El nomograma es una herramienta gráfica que permite calcular la potencia (FCR, escala C) de una centrífuga, expresada en «g», conociendo el radio de giro (escala A) y las r.p.m. (escala B) deseadas, sin necesidad de usar la fórmula. Se traza una línea recta uniendo el valor de la escala A con el de la escala B; el punto de intersección en la escala C corresponde a la FCR.

Otras Técnicas de Separación

1. Filtración

1.1. Concepto

Es la separación de las partículas de un sólido del líquido en el que se encuentra suspendido, mediante un cuerpo permeable y poroso (filtro). El líquido (filtrado) pasa a través de los poros de tamaño variable, mientras que el residuo sólido queda retenido.

1.2. Tipos de Filtros

Se emplean junto a un embudo cónico, donde se aloja el filtro plegado para aumentar la superficie de contacto.

• Papel de filtro: Se debe elegir el tamaño de poro adecuado en función del tamaño de las partículas sólidas a separar.
• Membranas filtrantes: Compuestas por polvo de vidrio aglomerado montado sobre un embudo o crisol. Presentan resistencia a la agresión química y permiten múltiples filtraciones.

1.3. Métodos de Filtración

• Filtración por gravedad: Se puede utilizar un filtro liso o un filtro de pliegues. La colocación en el embudo debe ser ajustada, superando el borde del embudo en al menos 1 centímetro.
  • Técnica de recogida:
    1. Dejar reposar el líquido para que sedimenten las partículas sólidas (acelera el filtrado).
    2. El filtro no debe llenarse hasta el borde.
    3. Verter el líquido a un ritmo adecuado.
    4. Evitar salpicaduras (la varilla del embudo debe tocar la pared del recipiente colector y estar por encima del nivel del filtrado).
  • Nota: Si el líquido no aparece claro, indica una porosidad no adecuada del filtro.
• Filtración por succión: Se utiliza un matraz especial llamado Kitasato. La filtración se produce por la diferencia de presión debida a la aplicación de vacío al recipiente donde se recibe el filtrado.

2. Diálisis

2.1. Concepto

Una bolsa construida con un material semipermeable (poros de 15 a 0,025 micras) se llena con la muestra. Mediante un proceso de difusión, se produce una filtración molecular: solo atraviesan la membrana los líquidos y las moléculas de menor tamaño, quedando retenidas las de mayor tamaño.

2.2. Utilidad

Enriquecimiento proteico en fluidos biológicos.

3. Decantación

Técnica:

1. Dejar reposar la mezcla para que el sólido sedimente.
2. Extraer el sobrenadante con una pipeta Pasteur o inclinar cuidadosamente el recipiente vertiendo el sobrenadante.

4. Extracción

4.1. Concepto

Separación de uno o más constituyentes de una mezcla mediante un disolvente.

4.2. Condiciones del Disolvente

Debe ser capaz de disolver completamente la sustancia a separar (poder separador) sin disolver el resto de componentes de la mezcla.

4.3. Utilidad

• Eliminar impurezas de una muestra.
• Obtener el enriquecimiento de compuestos químicos.

4.4. Clasificación

• Extracción sólido-líquido: Separación de uno o más componentes de una mezcla sólida mediante un disolvente líquido.
  • Fases:
    1. Poner en contacto el sólido con el disolvente.
    2. Separación del disolvente con el soluto disuelto del resto del sólido (generalmente, mediante filtración).
    3. Recuperación del soluto disuelto mediante técnicas como destilación o evaporación.

  Una variante es la extracción continua, que utiliza dispositivos para realizar extracciones eficientes con pequeñas cantidades de disolvente, como el sistema Soxhlet (ej. extracción de grasas en alimentos).

• Extracción líquido-líquido: La sustancia a extraer se encuentra en una disolución líquida y se extrae mediante un disolvente líquido inmiscible o poco soluble en la disolución original. La forma más sencilla de realizarla en laboratorio es mediante un embudo de decantación. Se agita la mezcla para poner en contacto ambas fases y luego se separan mediante la llave del embudo.

5. Destilación

5.1. Concepto

Separación, por acción del calor, de un líquido volátil de una sustancia no volátil o de otro líquido con un punto de ebullición diferente. Los vapores se recogen tras su condensación.

5.2. Fases

1. El líquido alcanza el punto de ebullición y pasa al estado de vapor.
2. El vapor se condensa y es recogido en un recipiente apropiado.

5.3. Tipos

• Simple: Permite separar un líquido de un sólido o dos líquidos cuyos puntos de ebullición difieran en más de 80ºC.
• Fraccionada: Se utiliza para separar mezclas de dos líquidos con puntos de ebullición muy próximos. El proceso se repite varias veces, obteniendo en cada etapa una mayor pureza del componente con el punto de ebullición más alto.

5.4. Descripción del Aparato

Consta de un matraz, un refrigerante y un recipiente colector.