Bioquímica Clínica: Parámetros y Patologías

Líquido Cefalorraquídeo (LCR): Diferencias en Meningitis

• Glucosa: Puede estar baja en ambas (más en bacterianas).
• Proteínas: Pueden estar altas en ambas (más en bacterianas).
• Aumento de células: Más pronunciado en bacterianas, con predominio polimorfonuclear (excepciones: tuberculosis, sífilis, listeria o brucella, que son mononucleares). En víricas, el predominio es mononuclear.
• LDH y Lactato: Altos en bacterianas.

Cristales Urinarios

Cristales Ácidos

• Ácido úrico
• Oxalato cálcico
• Uratos amorfos
• Tirosina
• Cistina
• Colesterol
• Leucina
• Ácido hipúrico

Cristales Alcalinos

• Fosfatos amorfos
• Fosfatos triples
• Carbonato de calcio
• Biurato de amonio
• Hidroxiapatita
• Carboxiapatita

Morfología de los Cristales

• Ataúd: Fosfato triple.
• Sobre, diamante: Oxalato cálcico dihidratado.
• Mancuernas (pesas): Oxalato cálcico monohidratado.
• Hexagonal: Cistina (también puede aparecer en orinas alcalinas, aunque con menor frecuencia).
• Limón: Ácido úrico (color macroscópico rosa en el fondo del tubo de orina).
• Manzanas espinosas: Biurato amónico.
• Forma rectangular refringente: Colesterol.
• Cruz de Malta en microscopía polarizada: Leucina.

Cristales Siempre Patológicos

• Colesterol (síndrome nefrótico, rotura de vasos linfáticos, etc.)
• Cistina
• Tirosina
• Leucina
• 2,8-dihidroxiadenina

Autoanticuerpos y Enfermedades Autoinmunes

• Anticuerpos ASCA (anti-*Saccharomyces cerevisiae*): Observados en enfermedad de Crohn.
• Anticuerpos antineutrófilos de patrón perinuclear (p-ANCA): Más frecuentes en colitis ulcerosa.

Enfermedad Celíaca (Sensibilización a la Gliadina)

• Cribado: Anticuerpos anti-transglutaminasa IgA + IgA totales (el déficit de IgA predispone a enfermedades autoinmunes como la enfermedad celíaca).
• Otros anticuerpos: Anticuerpos anti-péptidos deaminados de gliadina (anti-DGP IgA, anti-DGP IgG), anti-endomisio (EMA-IgA) y anti-reticulina.
• Predisposición genética: HLA DQ2 (DR3, DR5/DR7) y DQ8 (DR4).

Fibrosis Quística

• Enfermedad genética recesiva (alteración del gen *CFTR* en el cromosoma 7; la mutación más frecuente es F508del).
• Diagnóstico: Exceso de cloro en el sudor (Cl > 60 mmol/L; para inducir sudoración se administra pilocarpina por iontoforesis).
• Cribado neonatal: Tripsina inmunoreactiva alta.
• Se caracteriza por secreciones anormales de varias glándulas exocrinas.

Proteinograma: Electroforesis de Proteínas Séricas

• Método: Electroforesis de proteínas séricas (a pH 8.6 para que todas tengan carga negativa) y determinación por fotometría o espectrofotometría.
• Bandas: Albúmina, alfa-1, alfa-2, beta y gamma.
• Utilidad: Detección y seguimiento de bandas monoclonales.
• Tipos: Electroforesis capilar (ligeramente mejor) y electroforesis en gel de agarosa.
• Método de confirmación y caracterización (para tipificar): Inmunofijación.

Fracciones del Proteinograma

• Albúmina: Proteína más abundante, la más negativa (va al ánodo), menor punto isoeléctrico, mayor movilidad electroforética. Vida media: 20 días aprox. Función: transporte, mantiene la presión coloidosmótica.
• Causas de aumento de albúmina: Deshidratación.
• Causas de descenso de albúmina: Poca síntesis (malnutrición, malabsorción, mal funcionamiento hepático) o mucha pérdida (orina, heces…).
• Fracción alfa-1: Alfa-lipoproteína, alfa-1-glicoproteína ácida (orosomucoide), PROTROMBINA, alfa-1-microglobulina, alfa-1-antitripsina, transcortina.
• Fracción alfa-2: CERULOPLASMINA, alfa-2-macroglobulina, HAPTOGLOBULINA (disminuida en anemia hemolítica), eritropoyetina.
• Fracción beta: TRANSFERRINA, hemopexina, PCR, beta-2-microglobulina, FIBRINÓGENO (solo aparece si se utiliza plasma en el proteinograma), C3, C4.
• Fracción gamma: Inmunoglobulinas.
• Nota: La PCR puede aparecer al final de la fracción beta o al principio de la gamma. IgA e IgM pueden aparecer en otras fracciones además de la gamma.

Patrones Alterados del Proteinograma

• Cirrosis: Efecto puente entre las fracciones beta y gamma.
• Plasma: Banda beta en fibrinógeno.
• Mieloma: Banda monoclonal en gamma (excepciones en beta, como IgA).
• Bisalbuminemia: Albúmina en dos bandas.
• Síndrome nefrótico: Aumento de alfa-2-macroglobulina.

Medición de Proteínas

• Proteínas totales en suero:
  • Kjeldahl: Método de referencia; asume que el contenido en nitrógeno es constante.
  • Biuret: Muy utilizado; proporcional al número de enlaces peptídicos que reaccionan; el reactivo contiene iones de cobre.
• Proteínas individuales: Inmunonefelometría.
• Proteinograma: Electroforesis.
• Bandas monoclonales en mieloma: Electroforesis seguida de inmunofijación.
• Pequeñas concentraciones de proteínas (líquidos biológicos y orina): Ácido tricloroacético (precipitación), azul Coomassie brillante (método de Bradford), rojo pirogalol.

Marcadores de Desnutrición

• Más utilizados: Índice CONUT (colesterol, linfocitos, albúmina) y prealbúmina (tiene carga más negativa que la albúmina).
• Otros: Albúmina, transferrina, proteína transportadora de retinol y vitaminas.

Enfermedad de Wilson

• Trastorno genético autosómico recesivo (gen *ATP7B*) que causa acumulación de cobre.
• Hallazgos: Cobre y ceruloplasmina bajos en suero; cobre alto en hígado y en orina.
• Signo clínico: Anillo de Kayser-Fleischer.

Deficiencia de Alfa-1-Antitripsina

• Deficiencia homocigota (fenotipo ZZ) asociada a enfermedades pulmonares o hepáticas.

Reactantes de Fase Aguda

• Positivos: El más importante es la PCR.
• Negativos: Prealbúmina, albúmina, transferrina.

Marcador de Sepsis (Inflamación Sistémica)

• Procalcitonina.

Pruebas de Función Hepática

Amonio

• Preanalítica: Muestra en EDTA, mantener en frío, sin abrir, evitar ejercicio previo, no hemólisis, no fumar, analizar lo antes posible.
• Se eleva en: Síndrome de Reye, alteraciones del ciclo de la urea, encefalopatía hepática, enfermedad hepática severa, insuficiencia renal.

Bilirrubina

• Bilirrubina directa (conjugada): Ácido glucurónico, soluble, puede aparecer en orina (coluria).
• Causas de aumento de bilirrubina directa: Colestasis, enfermedad de Dubin-Johnson, enfermedad de Rotor. La enfermedad hepática puede aumentar ambas (directa e indirecta).
• Bilirrubina indirecta (no conjugada): Insoluble, no aparece en orina. En su defecto, en orina aparecerá urobilinógeno.
• Causas de aumento de bilirrubina indirecta: Anemias hemolíticas, eritropoyesis ineficaz, recién nacido, enfermedad de Gilbert, enfermedad de Crigler-Najjar.
• Ambas producen ictericia (coloración amarillenta).
• Métodos de determinación: Todos los que contengan el sufijo “-AZO-”. El más utilizado es el de Jendrassik-Grof (ácido sulfanílico diazotado; a la bilirrubina total se le añade DMSO, cafeína o etanol, ya que la indirecta no reacciona sin estos aditivos). La luz degrada la bilirrubina. La hemólisis es un interferente. Otros métodos: bilirrubina oxidasa, bilirubinómetro, método de Malloy y Evelyn, etc.
• Delta-bilirrubina: Bilirrubina directa unida a albúmina que aparece en pacientes con ictericia prolongada que se recuperan de hepatitis o de una obstrucción.
• Kernicterus: Acumulación de bilirrubina (fundamentalmente indirecta) en el tejido nervioso.

Transaminasas

• GOT (AST): Aspartato ↔ oxalacetato.
• GPT (ALT): Alanina ↔ piruvato.
• Se elevan en daño hepático. La GPT es más específica que la GOT.
• Cociente de Ritis (GOT/GPT): >2 en hepatopatías alcohólicas; <1 en hepatitis víricas.
• Ambas enzimas utilizan como cofactor piridoxal fosfato.
• Ambas se determinan por disminución de NADH.

Marcadores de Colestasis Hepática

• Fosfatasa alcalina
• GGT
• 5′-nucleotidasa
• Leucina aminopeptidasa
• Nota: La fosfatasa alcalina se eleva también en patología ósea (enfermedad de Paget), crecimiento y embarazadas. La GGT se eleva también en alcoholismo y por tóxicos debido a inducción enzimática.

Otros Marcadores Hepáticos

• Colinesterasa: Disminuye en intoxicación por organofosforados.
• Alcoholismo: GGT elevada (marcador con mayor sensibilidad), GOT >> GPT. La transferrina deficiente en carbohidratos (CDT) es útil para el seguimiento.
• Hemocromatosis (mutación C282Y, la más frecuente): Aumento de hierro, ferritina y saturación de transferrina.
• Alfa-fetoproteína: Marcador tumoral hepático.

Hepatitis Virales

• Los virus que empiezan por vocal (A, E) se transmiten por vía oral, no están envueltos y causan cuadros clínicos agudos.
• Los virus que empiezan por consonante (B, C, D, G, T) se transmiten por vía parenteral y pueden causar cuadros clínicos agudos, pero sobre todo crónicos. Son todos envueltos, excepto el virus de la hepatitis T.
• Mayor tendencia a la cronicidad: Hepatitis C > Hepatitis B+D > Hepatitis B.
• Todas son de ARN, excepto la hepatitis B (ADN).
• Familias virales:
  • Hepatitis A: Picornavirus.
  • Hepatitis B: Hepadnavirus (partícula Dane).
  • Hepatitis C: Flavivirus.
  • Hepatitis E: Hepeviridae.
  • Hepatitis D: Deltaviridae (agente delta).

Anticuerpos y Antígenos de Hepatitis B

• Antígeno de superficie o Australia (AgHBs): Indica infección actual.
• Anticuerpos anti-HBs: Indican curación. Positivos en personas vacunadas. Es el último marcador en aparecer.
• Anticuerpos anti-HBc: Indican que la persona ha estado en contacto con el virus (infección). IgM indica infección reciente, IgG indica infección no reciente. Es el primer anticuerpo que aparece.
• Antígeno HBe (AgHBe): Indica replicación activa y alta infectividad.
• Anticuerpos anti-HBe: Indican infección no activa.
• Anticuerpos en vacunados: Anticuerpos anti-HBs.
• Anticuerpos que perduran para siempre tras infección: Anticuerpos anti-HBc.

Genética y Biología Molecular: Diagnóstico y Técnicas

Alteraciones Cromosómicas

Numéricas

• Euploidía: Uno o más juegos completos de cromosomas. Puede ser:
  • Monoploidía: Un único juego (N).
  • Poliploidía: Varios juegos (3N, 4N, etc.).
• Aneuploidía: Alteración en el número de cromosomas sin afectar a juegos completos.
  • Monosomía (2N-1): Ausencia de un cromosoma. Ejemplo: Síndrome de Turner (45,X). Pacientes con fenotipo femenino, talla baja, aspecto senil, orejas de mayor tamaño, cuello corto, órganos sexuales internos poco desarrollados, ausencia de menstruación, etc.
  • Trisomía (2N+1): Existencia de un cromosoma extra. Ejemplos: Síndrome de Down (trisomía 21), síndrome de Edwards (trisomía 18), síndrome de Patau (trisomía 13), síndrome de Klinefelter (47,XXY) (hombres con testículos pequeños, ginecomastia, talla elevada, tendencia a la obesidad, menor desarrollo de los caracteres sexuales secundarios, ausencia de espermatogénesis).

Estructurales

• Deleción: Parte del cromosoma se pierde. A mayor afectación, mayores consecuencias fenotípicas. Ejemplo: síndromes de microdeleción.
• Duplicación: Ganancia de parte del cromosoma.
• Translocación: Intercambio de material genético entre cromosomas no homólogos. Se clasifican en:
  • Balanceadas: Si no conlleva ganancia o pérdida de material genético; no tendrán consecuencias genotípicas.
  • No balanceadas.
• Existe un tipo de translocación denominada Robertsoniana, en la que se unen los brazos largos de dos cromosomas acrocéntricos (13, 14, 15, 21, 22) por el centrómero. El fenotipo es normal, pero hay riesgo de genotipo anormal en la descendencia.
• Inversión: Resultado de dos roturas en un cromosoma seguidas de reinserción del fragmento en su sitio original, pero en orden inverso. Si incluye el centrómero se denomina pericéntrica; si no, paracéntrica.
• Isocromosoma: Cromosoma en el que se ha perdido un brazo y el otro se ha duplicado de forma especular.
• Inserción: Tipo de translocación no recíproca que ocurre cuando un segmento desprendido de un cromosoma se inserta en otro cromosoma en su orientación usual o invertida.

Alteraciones Monogénicas

• Son aquellas producidas por alteraciones en la secuencia de ADN de un solo gen.
• Dominantes: Neurofibromatosis, déficit de factor de von Willebrand, etc.
• Recesivas: Fibrosis quística.
• Ligadas al cromosoma X: Hemofilia.

Expansión de Tripletes

• Mutaciones dinámicas, porque la región cromosómica afectada se hace inestable y tiende a aumentar el número de repeticiones durante el proceso de división celular o mitosis (anticipación génica).
• Síndrome del X frágil: Gen *FMR1* ligado al cromosoma X, con más de 200 repeticiones de CGG consideradas patológicas (zona gris: 55-200 repeticiones).

Técnicas de Citogenética y Biología Molecular

Preanalítica en Genética

• Muestras: Heparina (para cariotipo), EDTA (para PCR).
• Recogida de muestras prenatales: Vellosidad corial (se recoge a las 8-11 semanas de gestación), líquido amniótico (14-15 semanas de gestación).

Fases del Cariotipo

1. Cultivo: Los linfocitos no se dividen en cultivo. Necesitan mitógenos para ello (fitohemaglutinina: linfocitos T). La tripsina se utiliza para levantar el cultivo.
2. Sacrificio: Con colchicina.
3. Choque hipotónico: Solución de Carnoy (metanol 3:ácido acético 1).
4. Fijación: Importante: antes de la extensión.
5. Extensión.
6. Envejecimiento.
7. Bandeo:
   • Bandeo G (Giemsa): Bandas oscuras (ricas en A-T, pocos genes activos). Bandas claras (ricas en C-G, más genes activos).
   • Bandeo C (Centrómero): Tiñe el centrómero y la heterocromatina (cromosomas 1, 9, 16, Y).
   • Bandas Q (quinacrina): Fluorescentes, similares a las G.
   • Bandas R: Inversas a las G.
   • Bandas NOR: Tiñen los satélites.
   • Bandas de alta resolución: Se detiene la división en profase.

FISH (Hibridación *in situ* Fluorescente)

• Se diseña una sonda (de ADN o ARN) complementaria a lo que se quiere buscar y se marca (generalmente con fluorescencia).
• Stringencia: Afinidad de la sonda por su ácido nucleico diana.
• Aplicaciones: Detección de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones, inversiones, etc.

Array CGH (Hibridación Genómica Comparada)

• Diagnóstico de síndromes de deleción/duplicación (rasgos dismórficos, retraso del crecimiento, discapacidad intelectual, convulsiones, epilepsia, malformaciones, trastornos del espectro autista, etc.).
• Tipos de Arrays:
  • Array CGH (Hibridación Genómica Comparada): Detecta deleciones y duplicaciones. Disponibles en diferentes resoluciones (ej., 60K, 180K, 400K).
  • Array SNP (*Single Nucleotide Polymorphism*): Se basa en la detección de un cambio de base, permitiendo detectar disomías uniparentales y pérdidas de heterocigosidad (LOH). Ofrece mejor detección de poliploidías donde hay más carga genética de un progenitor que de otro (ej., triploidías).
  • Array CGH+SNP o CNV-SNP: Combina las capacidades de los dos anteriores.

Técnicas de Transferencia o Blotting

• Generalmente se separan por electroforesis y posteriormente se identifican las fracciones.
• Southern: ADN.
• Northern: ARN.
• Western: Proteínas.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

• Conocida como la “fotocopiadora de ADN o ARN”.
• Reactivos: Cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), ADN polimerasa termoestable (*Taq* polimerasa; enzima que construye la nueva cadena), dos cebadores o *primers* (delimitan el material genético a amplificar), MgCl₂, KCl, tampón Tris-HCl.
• Equipo: Termociclador.
• Procedimiento:
  1. Desnaturalización (temperatura: 94°C durante 1 min): El ADN de doble cadena se separa en dos hebras sencillas.
  2. Hibridación (temperatura: 54°C durante 45 segundos): Acoplamiento de los *primers* a las hebras molde.
  3. Amplificación (temperatura: 72°C durante 2 min): Síntesis de la cadena complementaria en dirección 5´-3´.
• Tipos de PCR:
  • PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR o PCR-TI): Amplifica ARN a partir de ADNc.
  • PCR anidada (*nested* PCR): El producto de una PCR se usa como molde para una segunda amplificación, utilizando dos grupos de cebadores. Ofrece gran especificidad y baja contaminación.
  • PCR múltiple (*multiplex* PCR): Amplifica simultáneamente varias secuencias de ADN.
  • PCR en tiempo real (*real-time* PCR o qPCR): La amplificación se mide en tiempo real. Utiliza sondas como SYBR Green, FRET, o la tecnología TaqMan (basada en la actividad 5´-nucleasa de la polimerasa).
  • QF-PCR (*Quantitative Fluorescent* PCR): PCR *multiplex* para la amplificación de marcadores cromosómicos y su cuantificación mediante detección fluorescente tras electroforesis. Utilizada en el diagnóstico prenatal de aneuploidías.

MLPA (*Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification*)

• Método de cuantificación relativa del número de copias normales y anormales, basado en la PCR.

Secuenciación

• Técnicas destinadas a conocer el orden de los nucleótidos (A, G, C, T) en la molécula de ADN.
• Tipos: Secuenciación Sanger (*gold standard*) y NGS (*Next Generation Sequencing*).
• La secuenciación Sanger utiliza reactivos similares a la PCR, pero también didesoxirribonucleótidos marcados. Cuando estos se añaden, no se pueden añadir más nucleótidos. Se separa por electroforesis para determinar el nucleótido según el tamaño del amplificado.
• Métodos de secuenciación:
  • Pirosecuenciación: Basada en la detección de pirofosfato (PPi).
  • Secuenciación por síntesis.
  • Secuenciación por ligación: No utiliza ADN polimerasa, sino oligonucleótidos marcados.
  • Secuenciación por semiconducción de iones: Basada en la detección de iones H+ liberados durante la incorporación de nucleótidos.
• Abordajes de secuenciación según la patología:
  • Paneles de genes: Dirigidos a patologías específicas (ej., miocardiopatía dilatada) o sintomatologías (ej., epilepsia).
  • Exoma clínico: Incluye los exones de genes asociados a patologías conocidas.
  • Exoma completo (WES – *Whole Exome Sequencing*): Incluye todos los exones de todos los genes (aproximadamente el 2% del genoma).
  • Genoma completo (WGS – *Whole Genome Sequencing*): Secuenciación de todo el genoma.

Extracción de ADN

• Lisis del tejido.
• Separación de compuestos lipídicos.
• Desnaturalización proteica.
• Precipitación de ADN (se hace insoluble en presencia de sales).
• Redisolución.

Extracción y Manejo de ARN

• El ARN es muy lábil. La recogida de la muestra es un paso crítico y debe añadirse inmediatamente algún inhibidor de las ARNasas, como el Trizol o el dietilpirocarbonato (DEPC). Congelar inmediatamente.

Calidad y Cantidad de ADN/ARN

• Espectrofotometría:
  • Ácidos nucleicos: Absorbancia máxima a 260 nm (mínima a 234 nm).
  • Proteínas: Absorbancia máxima a 280 nm.
  • Relación 260/280: 1.7-1.9 es correcta.
  • Relación 234/260: <0.5 indica pureza correcta (más sensible).
• Electroforesis:
  • ADN: Banda única de aproximadamente 20 kb.
  • ARN: Fondo difuminado con dos bandas, siendo la más alta el doble de intensa que la más baja.

Simbología del Árbol Genealógico

• Hombre: Cuadrado.
• Mujer: Círculo.
• Individuo afectado: Coloreado.