Introducción a las Técnicas de Laboratorio

En el laboratorio, se trabaja con muestras homogéneas y heterogéneas. A menudo, es necesario separar los componentes de una mezcla para su estudio o purificación. La elección del método de separación depende de diversas propiedades físicas y químicas de los componentes, tales como:

• Tamaño de las partículas
• Punto de ebullición
• Densidad
• Solubilidad
• Carga eléctrica
• Afinidad y capacidad de absorción

Métodos de Separación de Mezclas

Filtración

La filtración es un proceso que utiliza un filtro con un tamaño de poro determinado para separar partículas sólidas de un fluido (líquido o gas). Su objetivo principal es obtener el residuo sólido o eliminar impurezas del fluido.

Tipos de Filtro:

• De papel: Económicos y de un solo uso, ideales para aplicaciones generales.
• De membrana: Utilizados para esterilización, fabricados con materiales como nailon, acetato de celulosa o nitrato de celulosa.
• De vidrio molido: Químicamente resistentes, con poros que varían de 2 a 200 µm.

Tipos de Filtración:

• Por gravedad: El líquido atraviesa el filtro por acción de la gravedad.
• Por vacío: Se emplea una bomba de vacío para acelerar significativamente el proceso.
• Microfiltración: Retiene partículas de 0,1 a 10 µm, eficaz para eliminar microorganismos e impurezas.
• Ultrafiltración: Retiene partículas de 0,005 a 0,1 µm, comúnmente usada en el tratamiento de aguas y en la industria farmacéutica.

Decantación

La decantación es un método de separación que se utiliza principalmente para mezclas heterogéneas. Si una fase es sólida, se deja reposar la mezcla hasta que el sólido se deposite en el fondo, y luego se separa cuidadosamente el líquido. Para líquidos inmiscibles, se emplea un embudo de decantación para separar las fases por diferencia de densidad.

Centrifugación

La centrifugación acelera el proceso de sedimentación de partículas mediante la aplicación de una fuerza centrífuga generada por rotación rápida. Es fundamental para separar componentes con pequeñas diferencias de densidad.

Clasificación de Centrifugadoras por Velocidad:

• Baja velocidad (4.000 – 15.000 rpm): Generalmente sin refrigeración, adecuadas para la separación de partículas grandes.
• Alta velocidad (18.000 – 25.000 rpm): Refrigeradas, empleadas para separar partículas más pequeñas.
• Ultracentrífugas (+50.000 rpm): Capaces de separar componentes celulares y macromoléculas.

Tipos de Rotor:

• Ángulo fijo: Los tubos se inclinan, y el sedimento se deposita en el fondo y lateral del tubo.
• Basculante: Los tubos se posicionan a 90º durante la rotación, con el depósito en el fondo.
• Vertical: Los tubos permanecen en posición vertical, y el depósito se forma en el lateral.

Tipos de Centrifugación:

• Analítica: Se utiliza para estudiar propiedades físicas de las moléculas (como masa molecular y coeficiente de sedimentación).
• Preparativa: Su objetivo es separar muestras para análisis posteriores.
• Diferencial: Una separación simple basada en el tamaño y la densidad de las partículas.
• Gradiente de densidad: Se emplea un fluido con un gradiente de densidad para separar partículas según su densidad de flotación.

Diálisis

La diálisis es un proceso de separación basado en los índices de difusión de las moléculas a través de una membrana semipermeable. Permite separar moléculas pequeñas de macromoléculas.

Destilación

La destilación es una técnica de separación que aprovecha las diferencias en los puntos de ebullición de los componentes de una mezcla líquida. Consiste en:

1. Evaporar el componente con menor punto de ebullición.
2. Condensar el vapor resultante en otro recipiente para obtener el componente purificado.

Cristalización

La cristalización es un método de purificación que se basa en la capacidad de ciertas sustancias para formar cristales sólidos a partir de una solución, un fundido o un gas. Permite obtener sustancias con alta pureza.

Precipitación

La precipitación es un proceso en el que se forma un sólido insoluble (precipitado) a partir de una solución. El precipitado se separa posteriormente por gravedad o centrifugación.

Tamizado

El tamizado es un método de separación de partículas sólidas de diferentes tamaños mediante el uso de tamices con poros de distinto diámetro. Es común en la industria y en el laboratorio para clasificar materiales.

Electroforesis: Separación de Moléculas Cargadas

La electroforesis es una técnica fundamental en bioquímica y biología molecular que separa moléculas cargadas (como proteínas y ácidos nucleicos) según su velocidad de migración en un campo eléctrico. Las moléculas positivas (cationes) se dirigen hacia el cátodo (-) y las negativas (aniones) hacia el ánodo (+).

Factores que Afectan la Migración:

• Carga de la molécula: A mayor carga neta, mayor velocidad de migración.
• Tamaño y forma: Moléculas más pequeñas y compactas migran más rápido.
• Tipo de soporte: La matriz del gel influye en la resistencia a la migración.
• Campo eléctrico aplicado: Un voltaje más alto acelera la migración.

Tipos de Soporte:

• Agarosa: Ideal para la separación de ácidos nucleicos (ADN, ARN) debido a su gran tamaño de poro.
• Poliacrilamida: Utilizada para la separación de proteínas, ya que permite un control más fino del tamaño de poro.

Reactivos Comúnmente Usados:

• Buffers (TAE, TBE): Mantienen el pH constante y proporcionan conductividad eléctrica.
• SDS (Dodecil Sulfato de Sodio): Se usa para desnaturalizar proteínas y conferirles una carga negativa uniforme, permitiendo la separación por tamaño.
• Colorantes (Azul de bromofenol): Se añaden a la muestra para seguir visualmente el progreso de la migración.

Revelado y Lectura de Resultados:

• Transiluminación: Para ácidos nucleicos, se usa un colorante intercalante (como bromuro de etidio) que fluoresce bajo luz UV.
• Fotodensitometría: Cuantifica la intensidad del colorante en las bandas para determinar la concentración de moléculas.
• Espectrofotometría: Las bandas se recortan del gel, las moléculas se extraen en una disolución y se cuantifican por espectrofotometría.

Interpretación de Resultados:

• Cuantitativa: Determina la cantidad de sustancia presente y el grosor de cada banda.
• Cualitativa: Confirma la presencia o ausencia de una molécula específica mediante la aparición de una banda.

Etapas del Proceso de Electroforesis:

1. Preparación de la Muestra:

   Cualquier muestra biológica puede someterse a electroforesis. En algunos casos, es necesario centrifugarla previamente, concentrar las moléculas de interés o realizar procesos de extracción de proteínas o ácidos nucleicos.

   En el momento de cargar la muestra en el gel, se debe:

   • Añadir un tampón de carga para aumentar la densidad de la muestra y evitar que flote sobre el tampón del gel.
   • Añadir un colorante para seguir visualmente la migración a través del soporte.
2. Preparación del Soporte (Gel):

   Se pesa la agarosa o poliacrilamida según el porcentaje necesario para el análisis. Se añade un volumen conocido de agua destilada; si el soporte es de agarosa, se debe calentar para que adquiera consistencia de gel. El líquido se vierte en el molde adecuado y se colocan peines de plástico que formarán los pocillos donde se cargará la muestra. Una vez solidificado el gel, se retiran los peines.

3. Carga de Muestras:

   Con micropipetas, se coloca cuidadosamente la muestra en cada pocillo. Es crucial cargar en el primer pocillo un marcador de pesos moleculares (o escalera de ADN/proteínas) para estimar el tamaño de las moléculas de la muestra. También se recomienda cargar un control positivo y otro negativo.

4. Electroforesis:

   Se cierra la tapa de la cámara de electroforesis, se conectan los electrodos y se seleccionan los parámetros adecuados (voltaje, intensidad y tiempo). Se pone en marcha la fuente de alimentación. Los componentes de la muestra y los del marcador de masas moleculares se separarán en bandas distintas a medida que migran a través del gel.

5. Revelado:

   Se utiliza un colorante específico en función de la molécula que se quiera identificar. El soporte se sumerge en el colorante y el exceso se elimina con una disolución aclaradora. En algunas ocasiones, el colorante puede añadirse a la muestra antes de cargarla en los pocillos, eliminando la necesidad de teñir el soporte después del proceso.

Métodos de Extracción de Biomoléculas

La extracción es el proceso de separar biomoléculas específicas de una muestra biológica. Los métodos varían según el tipo de molécula:

• Glúcidos: A menudo requieren la eliminación previa de proteínas y lípidos.
• Proteínas: Suelen implicar el uso de detergentes para solubilización y centrifugación para separación.
• Ácidos nucleicos: Comúnmente se extraen mediante lisis celular seguida de precipitación con etanol.
• Lípidos: Un método clásico es el de Folch, que utiliza una mezcla de cloroformo y metanol.

Cromatografía: Principios y Tipos

La cromatografía es una técnica de separación basada en la distribución diferencial de los componentes de una mezcla entre dos fases: una fase estacionaria y una fase móvil.

Fase Estacionaria:

• En columna: La fase estacionaria se encuentra empaquetada dentro de un tubo.
• Plana (papel o capa fina): La fase estacionaria está extendida sobre una superficie plana (papel o una capa delgada de adsorbente).

La separación de los componentes se produce según su afinidad por la fase estacionaria.

Fase Móvil:

• Líquida (HPLC – Cromatografía Líquida de Alta Eficacia): La fase móvil es un líquido que arrastra los componentes a través de la fase estacionaria.
• De gases (GC – Cromatografía de Gases): La fase móvil es un gas inerte que transporta los componentes volátiles a través de la columna.

Interacción con la Fase Estacionaria:

• De intercambio iónico: La separación se basa en la carga eléctrica de las moléculas y su interacción con grupos cargados en la fase estacionaria.
• De adsorción: Las interacciones se producen por adsorción de los componentes a la superficie de la fase estacionaria.
• De afinidad: Se basa en interacciones biológicas específicas (por ejemplo, anticuerpo-antígeno, enzima-sustrato).
• De exclusión molecular (o de filtración en gel): La separación se realiza por tamaño molecular; las moléculas más grandes eluyen primero.
• De reparto: La separación se basa en la solubilidad diferencial de los componentes en dos fases inmiscibles.

Interpretación de Resultados y Métodos Estadísticos

Los métodos estadísticos son herramientas esenciales en el laboratorio para validar los resultados experimentales. Permiten comprobar la exactitud y precisión de los datos obtenidos, así como extraer conclusiones significativas.

Informe de Laboratorio

Un informe de laboratorio es un documento técnico crucial que debe incluir:

• Gráficos y tablas claras para la visualización de datos.
• Una descripción clara y sin ambigüedades de los métodos y resultados.
• Un análisis estadístico riguroso de los datos.
• La confirmación o el rechazo de la hipótesis inicial planteada.

Conceptos Básicos de Frecuencia

• Xᵢ: Valor de la variable.
• nᵢ: Frecuencia absoluta (número de veces que aparece Xᵢ).
• fᵢ: Frecuencia relativa (nᵢ/N), es decir, la proporción respecto al total.
• Nᵢ: Frecuencia absoluta acumulada (n₁ + n₂ + … + nᵢ).
• Fᵢ: Frecuencia relativa acumulada (f₁ + f₂ + … + fᵢ).
• fᵢ%: Frecuencia relativa porcentual (fᵢ × 100).
• N: Total de datos o tamaño muestral.

Datos Agrupados en Intervalos

Se utiliza para organizar y analizar datos cuando el número de observaciones es grande o los valores son continuos.

• Marca de clase (Xᵢ): Es el punto medio de cada intervalo.
• Fórmula: Marca de clase = (Límite inferior + Límite superior) / 2

Medidas de Tendencia Central

Estas medidas describen el centro de un conjunto de datos.

Media (Promedio)

• Datos individuales: (x₁ + x₂ + ... + xₙ) / n
• Datos agrupados: (x₁⋅n₁ + x₂⋅n₂ + ... + xₖ⋅nₖ) / N (donde k es el número de clases)

Mediana (Valor Central)

Es el valor que divide el conjunto de datos ordenados en dos mitades iguales.

• Para un número impar de datos: Es el valor central.
• Para un número par de datos: Es el promedio de los dos valores centrales.

Mediana para Datos Agrupados

Fórmula: Mediana = Lᵢ + ((N/2 - Nᵢacc) / nᵢ) ⋅ h

• Lᵢ: Límite inferior de la clase mediana.
• Nᵢacc: Frecuencia absoluta acumulada antes de la clase mediana.
• nᵢ: Frecuencia de la clase mediana.
• h: Amplitud del intervalo de la clase mediana.

Moda para Datos Agrupados

Fórmula: Moda = Lᵢ + ((nₘ - nₐ) / ((nₘ - nₐ) + (nₘ - nₚ))) ⋅ h

• Lᵢ: Límite inferior de la clase modal.
• nₘ: Frecuencia de la clase modal.
• nₐ: Frecuencia de la clase anterior a la modal.
• nₚ: Frecuencia de la clase posterior a la modal.
• h: Amplitud del intervalo de la clase modal.

Medidas de Dispersión

Estas medidas indican la variabilidad o dispersión de los datos alrededor de la media.

Desviación Estándar

Mide la dispersión promedio de los datos respecto a la media.

Fórmula para la desviación estándar muestral: s = √(((x₁ - x̄)² + (x₂ - x̄)² + ... + (xₙ - x̄)²) / (N - 1))

Coeficiente de Variación (CV)

Fórmula: CV = (Desviación estándar / x̄) ⋅ 100%

Sirve para comparar la variabilidad entre conjuntos de datos con distintas unidades de medida o medias muy diferentes.

CHI CUADRADO (χ²)

El test de Chi Cuadrado (χ²) se utiliza para analizar si existe una relación estadísticamente significativa entre dos variables categóricas (por ejemplo, género y preferencia por un producto).

• H₀ (hipótesis nula): No existe relación entre las variables (son independientes).
• H₁ (hipótesis alternativa): Sí existe relación entre las variables (son dependientes).

Para su aplicación, se construye una tabla de contingencia que muestra las frecuencias observadas de las categorías de ambas variables.

Fórmula del estadístico Chi Cuadrado:

χ² = ∑((O - E)² / E)

• O: Frecuencia observada en cada celda de la tabla.
• E: Frecuencia esperada en cada celda, calculada bajo la hipótesis nula de independencia.
• Grados de libertad (gl): (Número de filas - 1) ⋅ (Número de columnas - 1)
• Criterio de decisión:
  • Si χ² calculado > valor crítico (obtenido de tablas Chi Cuadrado para un nivel de significancia y grados de libertad dados) ⇒ se rechaza H₀ (existe relación).
  • Si χ² calculado < valor crítico ⇒ no se rechaza H₀ (no hay evidencia suficiente de relación).