Técnicas de Separación en el Laboratorio

1. Centrifugación

La centrifugación es un método que busca acelerar la separación de un sólido contenido en un líquido. Para ello, se colocan los tubos con la mezcla a separar en una centrífuga y se les somete a un movimiento de rotación a las rpm deseadas durante el tiempo adecuado. Al finalizar este tiempo, se obtienen dos fases: líquido y sólido. En algunos casos, puede interesarnos recoger el sobrenadante (por ejemplo, plasma o suero sanguíneo), y en otros, el residuo sólido, como el sedimento de la orina.

Según el tipo de rotor empleado en la centrífuga, la Fuerza Centrífuga Relativa (FCR) actuará de distinto modo durante la centrifugación:

• Cabezal oscilante: Durante la centrifugación, las partículas se desplazan de forma constante a lo largo del tubo, de modo que el sedimento se distribuye uniformemente contra el fondo del mismo. Por ello, la superficie del sedimento es plana (perpendicular al eje de la centrífuga). El sobrenadante puede retirarse con una pipeta o por decantación, según lo compacto que quede el sedimento.
• Cabezal angular: Al actuar la FCR, las partículas son conducidas hacia fuera horizontalmente, pero chocan en el lado del tubo. El sedimento impacta contra el borde y el fondo de este, con la superficie del sedimento paralela al eje de la centrífuga. Al descender y parar, el sedimento se deposita en el borde interior del tubo a causa de la gravedad, formándose un sedimento menos compacto.

Las utilidades más frecuentes de la centrifugación son:

• Separación del suero o plasma.
• Concentración de células.
• Separación de sustancias.
• Aclarar líquidos orgánicos.
• Separar quilomicrones (lipoproteínas sintetizadas en el intestino) del suero para fraccionar las distintas lipoproteínas.

2. Filtración

La filtración es la separación de las partículas de un sólido del líquido con el que se encuentra en contacto, mediante la utilización de un cuerpo permeable y poroso a través de cuyos poros pasa fácilmente el líquido, quedando el sólido retenido.

El objetivo final es que la filtración sea rápida y que la retención del sólido sea total. Cuando el tamaño del poro elegido es excesivamente grande, el sólido atravesará el filtro, mientras que si es demasiado pequeño, la filtración será muy lenta.

Tipos de Filtros Utilizados

• Papel de filtro: Presenta poros cuyo diámetro es variable, lo que permite elegir en cada caso el más conveniente. Son de un solo uso y el filtro debe colocarse en un embudo adecuado. Existen filtros de papel endurecidos que presentan una mayor resistencia al agrietamiento por la humedad y la acción química de los ácidos y bases, aunque para paliar estos problemas es recomendable la utilización de las membranas filtrantes.
• Membranas filtrantes: Están formadas por polvo de vidrio aglomerado y ya están montadas sobre un embudo o sobre un crisol. Permiten llevar a cabo repetidas filtraciones y una adecuada limpieza. Son muy resistentes a la agresión química.

Métodos de Filtración

1. Por acción de gravedad: Utiliza papel de filtro colocado en un embudo en disposición vertical, por el cual desciende el líquido por acción de la gravedad.

   El filtro liso es el más indicado cuando se pretende recoger el sólido tras la filtración. Para su preparación, se necesita un círculo de papel de filtro que inicialmente se dobla por el diámetro y posteriormente por el radio perpendicular a ese diámetro. Por último, se corta un poco uno de sus extremos, se abre en forma de cono y se coloca en el embudo perfectamente ajustado y a un centímetro del borde del mismo. Cuando el filtro se adapta completamente al embudo, la filtración es más rápida. El filtro de pliegues puede prepararse fácilmente en el laboratorio a partir del papel de filtro.

   La filtración se lleva a cabo vertiendo a un ritmo adecuado aquello que se desea filtrar en el interior del embudo. Para evitar salpicaduras, es conveniente que la varilla del embudo toque la pared interior del vaso colector. Dicha varilla debe estar a la altura suficiente como para que se encuentre siempre por encima del nivel del filtrado. Siempre que sea posible, es conveniente dejar reposar la mezcla antes de filtrar para que las partículas sólidas sedimenten y la filtración sea más rápida. El filtro no debe llenarse nunca hasta el borde. Cuando, tras la filtración, el filtrado no aparece claro, hay que pensar en la posibilidad de que el filtro no tenga la porosidad adecuada.

2. Por succión: Utiliza como medio filtrante un papel de filtro colocado en un embudo especial provisto de una placa perforada o una placa filtrante montada en el embudo o en un crisol. El embudo se ajusta perfectamente a la boca del recipiente de recogida mediante una junta de goma.

   La filtración, más que por gravedad, se produce por succión. Para ello, se conecta el matraz Kitasato mediante una tubuladura lateral a una bomba de vacío. Como consecuencia del vacío generado, el líquido que se encuentra en el embudo es aspirado y la filtración se produce con cierta rapidez. En cualquier caso, es imprescindible que todas las conexiones estén bien ajustadas, evitando la entrada de aire en el interior del Kitasato.

   Cuando se utiliza papel de filtro como medio filtrante, este debe recortarse perfectamente ajustado a la medida del embudo y colocarse completamente liso, cubriendo todas las perforaciones del embudo. Al comenzar a filtrar, es conveniente utilizar un vacío moderado para evitar que las partículas más finas puedan atravesar el filtro y obstruyan los poros. Finalizada la filtración, es conveniente desconectar el dispositivo antes de cerrar el grifo. De lo contrario, es muy posible que entre agua y se mezcle con el filtrado.

3. Decantación

La decantación es un método de separación que consiste en mantener la mezcla a separar en reposo durante un cierto tiempo para que el sólido sedimente totalmente en el fondo del recipiente, y después, extraer cuidadosamente el sobrenadante con ayuda de una pipeta Pasteur o similar por succión. Un método alternativo, utilizado para el estudio del sedimento urinario, consiste en inclinar cuidadosamente el recipiente que contiene la muestra tras la sedimentación, vertiendo el líquido sobrenadante y manteniendo el sólido en el fondo.

Es un método menos eficaz que la filtración, siendo esta técnica más rápida cuando se hace después de una decantación.

4. Diálisis

En la diálisis, una bolsa o vaina con estructura de membrana semipermeable se llena con la muestra. Las macromoléculas presentes en la misma quedan retenidas, mientras que el líquido y las moléculas de menor tamaño atraviesan la membrana. El intercambio de material se produce por difusión y, por tanto, es un proceso lento. Un método para acelerarlo consiste en ejercer presión sobre la muestra que se ha de dializar. Las membranas utilizadas tienen diámetros de poro comprendidos entre 15 y 0,025 micras.

La filtración molecular se puede utilizar para el enriquecimiento proteico de fluidos biológicos que, como la orina o el LCR, son pobres en proteínas. El agua, las pequeñas moléculas y los electrólitos presentes en ellos atraviesan la membrana, mientras que las macromoléculas, especialmente las proteínas, al no poder atravesarlas, se van concentrando.

5. Extracción

La extracción es la separación de uno o más constituyentes de una mezcla mediante un disolvente. Para conseguir una buena extracción, el disolvente utilizado:

• Debe tener un buen poder separador, es decir, ser capaz de disolver perfectamente la sustancia que se quiere extraer, sin disolver a las restantes.
• Debe poder ponerse en contacto con la sustancia a extraer.

Este procedimiento se utiliza en el laboratorio con cierta frecuencia para eliminar impurezas de una muestra y conseguir el enriquecimiento de ciertos compuestos químicos.

Básicamente, pueden distinguirse dos tipos de extracción:

Extracción Sólido-Líquido

Consiste en la separación de uno o más componentes de una mezcla sólida mediante un disolvente líquido, y tiene lugar en dos etapas fundamentales: contacto del disolvente con el sólido y la separación de la disolución del resto del sólido.

En la primera etapa, se produce la separación de uno o más componentes de una mezcla sólida mediante un disolvente líquido. El proceso puede llevarse a cabo a temperatura ambiente o en caliente, en cuyo caso, para evitar pérdidas de disolvente, puede recurrirse a una ebullición a reflujo.

En la segunda etapa, cuando el disolvente ya se ha saturado, se procede a separarlo del sólido restante, generalmente mediante filtración. Cuando interesa recuperar el soluto, hay que completar el proceso con otras técnicas como la destilación o la evaporación.

Extracción Líquido-Líquido

La sustancia que interesa extraer forma parte de una disolución líquida y se extrae mediante un disolvente líquido. Para que la extracción sea efectiva, el líquido extractor debe ser insoluble o muy poco soluble en la disolución. Este método de extracción está basado en la ley de reparto, según la cual la relación existente entre las concentraciones de un mismo soluto en los disolventes no miscibles que están en contacto es una constante.

La forma más sencilla para efectuar una extracción consiste en agitar vigorosamente durante unos minutos la mezcla disolución/líquido extractor en una ampolla de decantación. Tras la agitación de la mezcla, puede producirse una sobrepresión en el interior del embudo de decantación que debe ser eliminada periódicamente durante el proceso de extracción, colocándolo invertido y abriendo la llave ligeramente.

Finalizada la extracción, se procede a separar las dos capas de líquido. Para ello, se deja reposar el embudo de decantación vertical durante el tiempo necesario. La capa situada en la parte inferior se extrae por la llave, mientras que la superior se extrae por la parte de arriba. Debido al pequeño diámetro del embudo de decantación en la zona cercana a la llave, la separación resulta mucho más sencilla y exacta.

6. Destilación

La destilación es un procedimiento que consiste en la separación, por acción del calor, de un líquido volátil de una sustancia no volátil o de otro líquido cuyo punto de ebullición sea diferente, recogiendo los vapores en un recipiente apropiado tras su condensación. Se desarrolla en dos etapas: durante la primera, el líquido alcanza su punto de ebullición y pasa a vapor; durante la segunda etapa, condensa y es recogido en un recipiente diferente.

La destilación puede ser de dos tipos:

Destilación Simple

Permite separar un líquido de un sólido o dos líquidos cuyos puntos de ebullición difieran en más de 80ºC. Un destilador consta básicamente de:

• Un matraz, donde hierve el líquido.
• Un refrigerante, en el que se condensan los vapores.
• Un recipiente colector, en el que se recoge el líquido ya condensado.

Destilación Fraccionada

Se utiliza para separar mezclas de dos líquidos cuyo punto de ebullición es muy próximo. Una destilación normal no permite separarlos debido a que el vapor formado contiene una mezcla de ambos. El componente más volátil de la mezcla se encontrará en mayor proporción en el vapor formado que en el líquido, de manera que si el vapor condensa y hervimos el líquido, en el vapor formado habrá aumentado la proporción de alcohol. De esta forma, por medio de varias destilaciones sucesivas, podrían separarse ambos líquidos.

Para simplificar y acelerar este proceso, se pueden emplear las llamadas columnas de destilación, de las cuales las más utilizadas en el laboratorio son:

• Las de relleno: En su construcción pueden utilizarse materiales distintos de formas diferentes.
• Las de Vigreux: Son enteramente de vidrio y presentan una serie de hendiduras que aumentan la superficie de contacto entre este y el vapor formado.