Fundamentos de las Separaciones Electroforéticas

La velocidad de migración de un ion, v, queda definida por la relación:

$$v = \mu E$$

Donde v está medida en centímetros por segundo (cm/s), E (Vcm^-1) es la intensidad del campo eléctrico y μ, es la movilidad electroforética (cm²V^-1s^-1).

Movilidad Iónica y Factores de Retardo

La movilidad electroforética es directamente proporcional a la carga eléctrica del analito e inversamente proporcional a los factores de retardo por roce.

• El campo eléctrico actúa solamente sobre los iones.
• Si dos especies difieren en la carga o en las fuerzas de roce, se moverán a través del tampón y se separarán.
• Las especies neutras no se separan.

Las fuerzas de retardo por roce se determinan en un analito cargado a partir del tamaño, de la forma del ión y de la viscosidad del medio en el cual migra.

Efecto Carga-Tamaño en la Migración

• Para iones del mismo tamaño, la fuerza impulsora será mayor en el de mayor carga, y tendrá una velocidad de migración más rápida.
• Para iones de la misma carga, la fuerza de retardo por roce será más pequeña para el ión más pequeño, y tendrá una velocidad de migración más rápida.

La relación carga-tamaño de los iones combina estos dos efectos.

Electroforesis Capilar (EC)

La Electroforesis Capilar es una técnica alternativa a la electroforesis convencional y surge debido a que la velocidad de separación y resolución de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo eléctrico aplicado.

Esta electroforesis se realiza en un tubo capilar con un diámetro interno inferior a 0,1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m.

Limitaciones de la Electroforesis Convencional

La electroforesis convencional ha sido y continúa siendo de gran utilidad; sin embargo, este tipo de separación electroforética presenta desventajas:

• Es lenta, laboriosa y difícil de automatizar.
• No proporciona resultados cuantitativos precisos.

La investigación y la aplicación de la electroforesis llevada a cabo en capilares tuvo un crecimiento explosivo durante la segunda mitad de la década de los ochenta, ello unido a la aparición de varios instrumentos comerciales.

Ventajas y Características de la Electroforesis Capilar

La electroforesis capilar da lugar a separaciones con:

• Volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL, en contraste con la electroforesis convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra del orden de µL).
• Una elevada resolución y rapidez.

Además, las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar, pudiendo utilizarse detectores cuantitativos, como los utilizados en HPLC.

Velocidades de Migración y Alturas de Plato en Electroforesis Capilar

Como se vio anteriormente, la velocidad de migración de un ión depende del campo eléctrico aplicado.

El campo eléctrico se determina por la magnitud del potencial aplicado (V) y la longitud L sobre la que se aplica:

$$E = V/L$$

Esta relación indica que es necesario que se apliquen potenciales elevados para obtener migraciones iónicas rápidas y una rápida separación. Si bien es deseable que las separaciones sean rápidas, es aún más importante obtener separaciones de alta resolución. Por ello, se hace necesario examinar los factores que determinan la resolución en la electroforesis.

Altura de Platos en Electroforesis Capilar

En cromatografía, tanto la difusión longitudinal como la resistencia a la transferencia de masa contribuyen al ensanchamiento de banda.

Para la electroforesis se ha demostrado que el número de platos (N) viene dado por:

$$N = \frac{\mu V}{2D}$$

Donde D es el coeficiente de difusión del soluto en cm²s^-1.

Debido a que la resolución se incrementa al aumentar el número de platos, es aconsejable aplicar potenciales elevados con la finalidad de obtener separaciones con elevada resolución.

Flujo Electroosmótico (FEO)

El Flujo Electroosmótico se origina cuando se aplica un potencial elevado a través de un capilar que contiene un tampón. Debido a este flujo, el disolvente migra hacia el cátodo o el ánodo. La velocidad de migración puede ser apreciable.

Mecanismo del Flujo Electroosmótico

La causa del flujo electroosmótico es la doble capa eléctrica que se forma entre la interfase sílice/disolución.

1. A valores de pH por encima de 3, la pared interna de un capilar de sílice presenta carga negativa debido a la ionización de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie.
2. Los cationes del tampón se agrupan sobre la superficie negativa del capilar de sílice, formando la doble capa eléctrica.
3. Los cationes, situados en la capa exterior difusa de la doble capa, son atraídos hacia el cátodo o electrodo negativo.
4. Dado que los cationes están solvatados, arrastran al resto de la disolución con ellos, a lo largo del capilar.

Perfil de Flujo

La electroósmosis conduce a un flujo en la disolución que tiene un perfil plano, perpendicular al capilar (a), diferente al perfil parabólico del flujo en cromatografía líquida, cuyo origen es la presión (b).

Debido al perfil esencialmente plano, el flujo electroosmótico no contribuye de manera significativa al ensanchamiento de banda del modo que lo hace el flujo en (b).

Efecto del FEO en la Migración

La velocidad del flujo electroosmótico es generalmente mayor a las velocidades de migración electroforética de los iones individuales. Llega a ser, en la práctica, el mecanismo de bombeo de la fase móvil en la electroforesis capilar de zona.

Aunque los analitos migran según sus cargas dentro del capilar, la velocidad del flujo electroosmótico es normalmente suficiente como para arrastrar a todas las especies (cargadas positivamente, neutras y negativas) hacia el mismo extremo del capilar. De esta manera, todas las especies pueden detectarse al pasar por un punto común. Se obtiene un electroforegrama que es similar a un cromatograma.

La velocidad de flujo electroosmótico viene dada por:

$$v_{eo} = \mu_{eo} E$$

Por lo tanto, en presencia de electroósmosis, la velocidad del ión quedará definida por:

$$v_{total} = v_{ep} + v_{eo} = (\mu + \mu_{eo}) E$$

Consecuencias del Flujo Electroosmótico en la Separación

Como consecuencia de la electroósmosis, el orden de elución en una separación por electroforesis es:

1. Primero los cationes más rápidos, seguidos por los más lentos.
2. Todas las especies neutras, en una única zona.
3. Finalmente, los aniones más lentos seguidos de los más rápidos.

La electroósmosis es a menudo deseable en ciertos tipos de electroforesis capilar, pero no lo es en otros. Puede eliminarse el flujo electroosmótico por recubrimiento de la pared interna del capilar con un reactivo como trimetilclorosilano, que elimina los grupos silanol de la superficie.