Productos Biológicos y Rangos de Tamaño Molecular

A continuación, se presentan rangos de tamaño molecular (expresados en Daltons) para diversos productos biológicos:

• 1 – 20.000 Da: Biorreactores.
• 40 – 80.000 Da: Enzimas para biología molecular.
• 100 – 150.000 Da: Algunas enzimas y antibióticos; Antibióticos de amplio espectro (β-lactámicos, aminoglucósidos); Enzimas alimentarias (proteasas, amilasas).
• 200 – 500.000 Da: Aminoácidos.

Técnicas de Inmovilización Celular

La inmovilización celular es crucial para la reutilización de biocatalizadores. Existen varios métodos:

Asociación Física

• Se realiza mediante resinas de intercambio iónico.
• Las células con carga negativa se adhieren a una resina con cargas positivas.
• La unión es débil y puede romperse con facilidad, lo que impediría recuperar el medio de cultivo libre de células.

Unión Covalente

• Se utilizan compuestos como glutaraldehído, tolueno diisocianato o yodoacetilcelulosa.
• Estos compuestos presentan cierta toxicidad, lo que puede inactivar a los microorganismos sensibles.

Atrapamiento (Método Más Utilizado)

Se emplean matrices como colágeno, gelatina, agar, alginatos, poliacrilamida o poliestireno.

1. Se mezclan las células con el producto líquido.
2. Se deja solidificar o polimerizar.
3. Una vez sólido, se fragmenta o granula.
4. Se empaqueta en una columna y se rellena el fermentador con ella.

Biorreactores Especializados y Materias Primas

Otros Biorreactores (Cultivos Fotosintéticos)

• Diseñados para el cultivo de microorganismos fotosintéticos (bacterias fotosintéticas, microalgas).
• Requieren un control estricto de los ciclos de luz y oscuridad.

Fuentes de Carbono: Almidón

El almidón es un polímero de glucosa que se obtiene habitualmente del maíz.

• Es más barato que la glucosa.
• Es una excelente fuente de carbono para:
  • Microorganismos amilolíticos (que poseen amilasas y pueden hidrolizarlo).
  • Microorganismos no amilolíticos, siempre que se realice una hidrólisis previa (lo que encarece el proceso y puede reducir la rentabilidad).

Líquido de Maceración del Maíz (Corn Steep Liquor)

Se forma durante la producción de almidón a partir de maíz. Su composición incluye:

• Nitrógeno: 4%.
• Aminoácidos libres.
• Algunos azúcares.
• Ácido láctico.

Preparación del Inóculo y Condiciones de Esterilización

Tiempo y Temperatura de Inactivación

Condiciones típicas de tiempo (minutos) y temperatura (°C) para la inactivación de diferentes formas microbianas:

Forma Microbiana	Tiempo (min)	Temperatura (°C)
Células vegetativas	5 – 10	60
Esporas de hongos	15	80
Esporas bacterianas	5	121
Esporas de B. stearothermophilus	15	121

Multiplicación del Inóculo

Tiempos de incubación requeridos según el método de preservación:

Método de Preservación	Tiempo de Incubación
Liofilizados	4 – 10 días
Congelados	Bacterias: 4 – 48 h; Actinomicetos: 1 – 5 días; Hongos: 1 – 7 días
Cultivos refrigerados	Bacterias: 4 – 24 h; Actinomicetos: 1 – 3 días; Hongos: 1 – 5 días

Cultivo de Prefermentación

Concentración de inóculo recomendada para el cultivo de prefermentación:

• Actinomicetos: 5 – 10%
• Otras bacterias: 0,1 – 3%
• Hongos: 5 – 10%

Métodos de Separación y Purificación

Técnicas de Separación Basadas en Propiedades Físicas

• Filtración en gel: Separa por peso molecular.
• Intercambio iónico: Separa por carga.
• Afinidad: Separa por actividad biológica.
• Adsorción: Separa por interacciones hidrofóbicas.

Extracción Líquido-Líquido

Cuando se aplica a productos biológicos, tiene la función tanto de separación como de concentración.

1. Consiste en mezclar el caldo acuoso de la fermentación con un solvente inmiscible.
2. El producto de interés debe disolverse en el solvente y poder ser separado de forma fácil y específica.
3. Se obtienen dos fases: una acuosa (que se retira) y el solvente con el producto.

Ejemplo: Para la penicilina, una vez finalizada la fermentación, se añade acetato de butilo como solvente. Posteriormente, se precipita con acetato potásico en una solución etanólica y el producto se deseca. El producto puede ser purificado adicionalmente.

Ingeniería Genética: Mutantes de Interés Industrial

La modificación genética de cepas permite optimizar la producción de metabolitos.

• Auxótrofos: Mutantes que requieren un nutriente específico que la cepa silvestre puede sintetizar. Tienen distintas utilidades y son muy importantes.
• Desregulados: Mutantes que alteran los mecanismos de inducción, represión catabólica y regulación por producto final.
  • Inducción.
  • Represión catabólica.
  • Regulación por producto final.
• Hipersecretores: Mutantes que tienen la capacidad de secretar de forma eficiente el metabolito de interés al medio.

Clonación Molecular y Expresión Heteróloga

Proceso de Clonación

El objetivo es introducir el gen de interés en un vector de expresión.

1. Obtención del gen: Si el ADN cromosómico está secuenciado, se diseñan dos cebadores que flanqueen el gen para separarlo del genoma y amplificarlo mediante PCR. Posteriormente, se realiza la purificación.
2. Introducción en el vector (Ligación): Se liga el gen al vector preparado, es decir, con la secuencia abierta (el “hueco”).

• Preparación del vector: Se corta con enzimas de restricción (endonucleasas) para obtener fragmentos con extremos lineales.
• Se deben cortar las secuencias de ADN a introducir con las mismas enzimas para que los extremos sean complementarios al hueco del vector.
• Inclusión de genes: Se sellan los enlaces con una ligasa, obteniendo el vector recombinante.

Transformación: Se incluyen los vectores en un medio junto con las células microbianas de interés. A veces, las células se tratan con cloruro para aumentar su permeabilidad y facilitar la entrada del plásmido.

Expresión

Si E. coli se encuentra en el medio adecuado, el gen de interés se transcribirá a ARNm y se traducirá a proteína, la cual se acumula en el citoplasma. Las células del microorganismo actúan como una fábrica produciendo el producto. Este sistema es tan importante que existe una revista científica dedicada exclusivamente a publicar avances en expresión heteróloga.

Componentes Clave del Vector de Expresión

Origen de Replicación (ori)

• Proviene de un plásmido críptico (natural).
• Permite la replicación autónoma, independiente de la célula.
• Ejemplo: En E. coli, es normalmente Col E1 (un plásmido natural de E. coli sin interés, pero con un ori muy activo).

Marcador Seleccionable

Normalmente, son genes que codifican resistencia a antibióticos. Son esenciales para seleccionar las células que se transformaron adecuadamente.

• Ampicilina.
• Tetraciclina.
• Cloranfenicol.
• Zeozina.

Cassette de Expresión

Región del plásmido donde se clona el gen a expresar.

• Promotor eficiente: El promotor bajo el cual se expresa el gen (donde se fija la ARN polimerasa para transcribir) debe ser eficiente, es decir, funcionar bien.
  • Posee dos regiones consenso conservadas en las posiciones -35 (TTGACA) y -10 (TATAAT), esenciales para que funcione correctamente y sea reconocido por la ARN polimerasa.
  • La posición +1 es el primer nucleótido que se transcribe. Se cuenta a partir de esta hacia atrás (-10 y -35).
  • Los promotores cuyas secuencias se parecen más a las secuencias tipo son más eficientes porque son más fácilmente reconocidos.
  • Es la parte más importante del cassette en temas de producción, ya que es manipulable para aumentar su efectividad.
• Secuencia Shine-Dalgarno (RBS: Ribosome Binding Site): Es complementaria del extremo 3′ del ARNr 16S, siendo la zona reconocida por el ribosoma para comenzar la traducción.
• Codón ATG: Señala el comienzo de la traducción. Puede formar parte del vector de expresión o estar ya en el propio gen de interés.
• Gen de interés a expresar: Si el gen ya lleva el codón ATG, no es necesario que esté en el plásmido.
• Región Poliligadora (MCS: Multicloning Site): Contiene secuencias de corte para distintas endonucleasas de restricción. Una de las formas más habituales de introducir el gen es cortar tanto el gen como el plásmido con las mismas enzimas.
• Terminador de Transcripción: Cuando se transcribe a ARN, forma una estructura de horquilla que provoca que la ARN polimerasa se separe o desligue del ARN.

Problemas en Sistemas de Expresión Procarióticos

La expresión de proteínas heterólogas en sistemas procarióticos puede enfrentar varios desafíos:

• Estabilidad del ARNm.
• Eficiencia de la traducción.
• Plegamiento de la cadena polipeptídica.
• Estabilidad de la proteína sintetizada.
• Modificaciones postraduccionales.
• Secreción de proteínas.