Recuento Leucocitario Hemocitométrico

Fundamento

La sangre se diluye 1:20 con una solución que produce hemólisis de los eritrocitos y conserva intactos los leucocitos. Los glóbulos blancos contenidos en un área específica son contados en una cámara especial (Cámara de Neubauer) y el número hallado se multiplica por un factor, para obtener el número de leucocitos por milímetro cúbico ($ ext{mm}^3$) de sangre.

Llenado de la Cámara de Neubauer y Recuento Celular

El procedimiento para el llenado y recuento de las células es el siguiente:

1. Limpie cuidadosamente la cámara de Neubauer hasta que quede desprovista de polvo y partículas extrañas.
2. Coloque el cubrehematímetro de manera que cubra ambos retículos de la cámara.
3. Con la pipeta automática, aspire la mezcla de líquido de dilución y sangre.
4. Coloque una gota de tamaño adecuado en el borde del cubrehematímetro, de modo que todo el retículo se llene por capilaridad de una sola vez. Si la gota es demasiado grande, el líquido se derramará. Si la gota es demasiado pequeña, no se llenará completamente el retículo. En ambos casos, el llenado es incorrecto y se debe limpiar la cámara y proceder a llenarla nuevamente.
5. Una vez cargada la cámara, se deja en reposo durante 1-2 minutos para que se sedimenten las células.
6. Se observa al microscopio con el diafragma cerrado, condensador bajo y objetivo de 10X. Antes de contar, se determina si los glóbulos están bien distribuidos, si hay burbujas de aire y/o si existen partículas extrañas.
7. Se enfoca con el tornillo micrométrico y al mismo tiempo se comenzará a contar los leucocitos hasta completar todas las células presentes en los 16 cuadraditos que conforman cada cuadrante (son 4 cuadrantes en total, identificados en la figura 1 como A, B, C, D).
8. Para evitar el error de contar dos veces la misma célula, especialmente las que se encuentran sobre las líneas de los cuadros, se contarán todas las células menos las que toquen las líneas derecha e inferior.
9. Después de contar los glóbulos de un cuadrante, se anotará esta cifra y se proseguirá contando y anotando cada uno de los resultados de los cuadrantes restantes.
10. El número total de células (N) está representado por la suma de los 4 cuadrantes contados. Este número se multiplica por un factor representado por el número “50”, con la finalidad de obtener el número de leucocitos por $ ext{mm}^3$ de sangre.

Cálculo del Recuento Leucocitario

$$\text{Nº Leucocitos} / \text{mm}^3 = N \times 50$$

Donde $N = A + B + C + D$ (suma de los leucocitos contados en los cuatro cuadrantes).

Recuento Leucocitario Diferencial (Hemograma de Schilling)

Fundamento

El recuento diferencial se refiere al número de cada uno de los diferentes tipos de leucocitos que se observan al realizar el contaje de 100 células leucocíticas en un frotis sanguíneo teñido con colorante de Giemsa, Wright u otro equivalente. El valor de cada uno de los tipos de leucocitos se expresará en porcentaje (%) y representará el Valor Relativo de cada uno de ellos.

Técnica General

Para realizar el Hemograma de Schilling o Recuento Diferencial, se debe comenzar haciendo un frotis o extendido sanguíneo que se coloreará con el colorante hematológico seleccionado (Giemsa, Wright, Diff Quick, Hemacolor, etc.).

1. Elaboración del Frotis Sanguíneo

1. Se toman dos láminas portaobjetos limpias.
2. Tome una de ellas entre los dedos pulgar e índice de la mano izquierda.
3. Mezcle la sangre varias veces por inversión suave.
4. Con un aplicador, se coloca una pequeña gota de sangre en uno de los extremos de la lámina.
5. Con la mano derecha, tome la segunda lámina (cubreobjeto extensor). Coloque uno de sus bordes laterales delante de la gota de sangre, haciendo contacto suavemente con la primera lámina.
6. Retroceda la lámina extensora hasta que toque la gota y esta se extienda por capilaridad a lo largo del borde de la misma. Mantenga una inclinación de 30 grados entre ambas láminas.
7. Una vez que el borde del portaobjeto extensor se impregna completamente de sangre, este se desliza hacia delante sin hacer presión excesiva sobre la lámina. Se debe mantener un movimiento rápido, uniforme y continuo, de modo que la sangre forme una delgada película.
8. El frotis se seca realizando movimientos al aire. No se debe utilizar calor ni dejar que se seque en reposo.

Condiciones de Calidad del Frotis Sanguíneo

Una buena extensión de sangre debe cumplir las siguientes condiciones:

• Debe ser gruesa en uno de los extremos y fina en el otro.
• Debe ser de aspecto regular y uniforme.
• No debe presentar lagunas (indican presencia de grasa en la lámina portaobjeto).
• No debe presentar digitaciones o rayas (se forman cuando están presentes partículas de sucio o por irregularidades del borde del cubreobjeto extensor).
• Debe estar sin ondulaciones (se presentan cuando se realizan movimientos impropios con la mano al realizar la extensión).
• Se debe realizar la coloración del frotis dentro de los 30 minutos siguientes a su elaboración. En caso contrario, se debe fijar el frotis con alcohol metílico.

2. Tinción del Frotis Sanguíneo

Se pueden utilizar diversos colorantes, siendo los más comunes Wright y Giemsa.

Composición de los Colorantes

• El colorante de Wright consiste en azul de metileno policromo con bicarbonato de sodio, al que se le agrega eosina.
• El colorante de Giemsa consta de Eosina-azur II en relación 15:4, además de Azur I y Azur II.

Los azures son colorantes básicos y, por lo tanto, son atraídos por la acidez nuclear (ácido nucleico), mientras que la eosina es un colorante ácido y, por tanto, es atraída por el citoplasma alcalino. Los colorantes neutros son solubles en alcohol metílico o etílico absoluto, pero estos tienden a retener el colorante y no es absorbido por el citoplasma celular. Por lo tanto, es necesario desplazar el colorante de la solución agregando agua que lo precipita.

El agua debe tener un pH adecuado a fin de obtener una mejor coloración diferencial. Si el agua es demasiado alcalina, facilita la coloración con azul de metileno o azur, haciendo que la célula se torne muy basófila. Si el agua es demasiado ácida, se intensifica la coloración con la eosina y la célula se torna rosada.

Método de Wright (Coloración de Wright)

1. El frotis secado al aire se cubre totalmente con colorante de Wright sin diluir.
2. Se deja actuar durante 1 minuto.
3. Sobre el colorante, se agrega igual cantidad de agua neutra o solución amortiguadora de pH. Se mezcla soplando hasta que se forme una película metálica en la superficie de la mezcla, dejándola actuar durante 3 minutos.
4. Se lava la preparación con agua corriente o neutra, teniendo cuidado de no lavar excesivamente y dañar la preparación.
5. El frotis teñido se deja secar colocándolo en posición vertical.

Método de Giemsa (Coloración de Giemsa)

El colorante de Giemsa se debe diluir inmediatamente previo a su uso, por lo tanto, es el primer paso a realizar. Para ello se utilizará la siguiente dilución:

1. Se añaden cinco gotas del colorante por cada mililitro de agua destilada o Buffer de coloración utilizado (5 ml por lámina).
2. Mezclar.
3. Una vez realizado el frotis sanguíneo, este se fija con Metanol durante 5 segundos.
4. El frotis se colorea cubriendo la lámina con la solución de Giemsa diluida, de acuerdo a las indicaciones previas.
5. Cubrir durante 15 minutos.
6. Descartar el colorante.
7. Lavar con agua.
8. Secar al aire.
9. El frotis estará listo para su observación al microscopio y realización del Hemograma de Schilling.

3. Técnica para el Recuento Diferencial o Hemograma de Schilling

1. El frotis teñido por alguno de los métodos señalados, se examina primeramente con lente 10X para observar la distribución de las células.
2. A continuación, examine con lente de 100X y aceite de inmersión.
3. Realice un recuento de por lo menos 100 células blancas para de esta manera establecer el porcentaje de cada uno de los diferentes tipos de leucocitos.
4. Se recomienda contar diferencialmente 100 células por cada 10.000 leucocitos por $ ext{mm}^3$ presentes en el contaje total de leucocitos.
5. Al realizar el recuento diferencial, la lámina se puede recorrer de tres formas diferentes.

Examen Morfológico de los Leucocitos

A medida que se realiza el recuento diferencial, se deben examinar las células con cuidado, ya que esto proporcionará datos importantes para el diagnóstico. Se tomarán en cuenta los siguientes aspectos:

• Distribución y características.
• Tamaño.
• Citoplasma (color, cantidad, vacuolas, gránulos normales y tóxicos).
• Núcleo.
• Signos de inmadurez.
• Células atípicas.
• Microorganismos intracitoplasmáticos: Ehrlichia sp, Hepatozoon.
• Inclusiones virales (Distemper canino).

Valores Absolutos y Relativos de los Leucocitos

Valor Relativo (V.R.)

Es el obtenido en el Hemograma de Schilling, se expresa en tanto por ciento (%) de los diferentes tipos de leucocitos presentes en el frotis. Cuando se van a interpretar los resultados de los análisis de las células blancas, este valor puede inducir a error en la interpretación, ya que un porcentaje elevado en un tipo de célula puede deberse a una disminución del número de células de otro tipo.

Causas Comunes de Error en el Contaje de Leucocitos

1. Durante la recolección de la muestra:
   • Uso inadecuado de anticoagulantes líquidos. Si existe exceso de anticoagulante, la muestra quedará diluida. Si hay menos cantidad de la necesaria, se formarán pequeños coágulos, donde quedarán atrapados los leucocitos. En ambos casos se obtienen contajes erróneos.
   • Mezcla insuficiente de la sangre y el anticoagulante.
   • Hemólisis de la muestra debida al uso de jeringas y/o agujas húmedas, exceso de vacío en la aspiración, presión al expulsar la sangre de la jeringa sin retirar la aguja, contaminación con productos químicos, etc.
2. Uso de materiales no calibrados: Uso de hemocitómetros y pipetas que no están garantizadas por el fabricante de acuerdo a las normas oficiales de calibración.
3. Dilución incorrecta: Dilución incorrecta por mediciones inadecuadas del líquido de dilución y sangre.
4. Errores de recuento: Errores de recuento debido a defectos de iluminación, uso de materiales y líquidos sucios, o falta de conocimiento al identificar las células.