Interferencias y Calibrado en Fotometría de Llama

Se utiliza el llamado estándar interno para controlar la variabilidad de la llama. El patrón interno es una sustancia que está ausente en la muestra y emite a una longitud de onda alejada de los elementos que se van a medir.

Espectrofotometría de Emisión Molecular (Luminiscencia)

Se entiende por luminiscencia todo fenómeno de emisión de luz que no está asociado a altas temperaturas.

Se basa en la medición de la intensidad de la luz emitida para determinar la concentración de la sustancia luminiscente en la muestra.

Tipos de Luminiscencia

• Bioluminiscencia: Reacciones químicas procedentes de organismos vivos que producen luz.
• Fotoluminiscencia: La excitación tiene lugar por absorción de fotones. Incluye la fluorescencia y la fosforescencia.
• Quimioluminiscencia: La energía de excitación proviene de una reacción química.

Fotoluminiscencia

Para que una sustancia origine emisión fotoluminiscente es necesario que previamente tenga lugar la absorción de radiación electromagnética y que un electrón pase a un nivel energético superior. Este electrón, al volver a su estado fundamental, emite una radiación de mayor longitud de onda que la recibida (menor energía).

Fluorescencia y Fosforescencia

• Fluorescencia: Periodo de emisión corto, aproximadamente $10^{-8}$ segundos.
• Fosforescencia: Periodo de emisión largo, pudiendo durar horas.

Espectrofotometría de Fluorescencia

La intensidad de luz emitida por las moléculas es proporcional a su concentración en la muestra, a la intensidad de la fuente de luz emisora y al instrumento de medición.

Instrumentación en Fluorimetría

Los instrumentos de fluorimetría requieren:

• Dos monocromadores que seleccionan las longitudes de onda de entrada y salida: uno de excitación para la luz incidente y otro de emisión para la luz fluorescente.
• Las cubetas deben ser de cuarzo, porque las de plástico pueden causar fluorescencia adicional.
• Los componentes están diseñados en ángulo recto para que la luz procedente de la lámpara (de excitación) no llegue directamente ni al monocromador de emisión ni al detector.

Quimioluminiscencia

Se produce cuando una reacción química genera una molécula excitada electrónicamente, la cual emite luz al volver a un estado de menor energía.

La reacción química que se produce es la oxidación de un compuesto orgánico por un oxidante, y la luz es emitida por el producto formado en la reacción de oxidación.

• Aplicación: Inmunoanálisis.

Espectrofotometría de Dispersión

Esta técnica trabaja con suspensiones. Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión, una parte de esa luz es dispersada, absorbida, reflejada y transmitida.

La dispersión y la intensidad de la luz dependen de varios factores:

• Longitud de onda de la radiación incidente.
• Tamaño y peso molecular de la partícula.
• Distancia entre la cubeta de la muestra.
• Concentración de partículas.

Estos factores se relacionan mediante la Ley de Rayleigh, que expone que la dispersión de luz es directamente proporcional a la concentración de partículas de la muestra.

Las técnicas que permiten la determinación de la concentración de partículas en suspensión son la turbidimetría y la nefelometría. En el laboratorio clínico se usan para determinar las proteínas plasmáticas.

Turbidimetría

Técnica de análisis cuantitativo que consiste en medir la disminución de la intensidad del haz de luz (transmitancia) que atraviesa la cubeta que contiene la suspensión, debido a fenómenos de dispersión.

• Es una técnica poco sensible.
• Se utiliza cuando las concentraciones de la partícula en suspensión son altas.
• El instrumento utilizado es el espectrofotómetro de absorción molecular VIS-UV.
• La concentración de las partículas es inversamente proporcional a la luz transmitida y se cumple la Ley de Beer.

Nefelometría

Técnica de análisis cuantitativo de suspensiones que consiste en medir la intensidad de luz dispersada en un ángulo determinado.

• Los instrumentos son parecidos a los fluorímetros.
• La longitud de onda que se emite es igual a la que se mide (la dispersada).

Refractometría

Técnica de análisis cuantitativo basada en el fenómeno de refracción de la luz.

El Fenómeno de la Refracción

La refracción es el desvío o cambio de dirección que experimenta un haz de luz al atravesar una solución sobre la que incide, ocasionado por la diferente naturaleza del medio de propagación. La Ley de Snell relaciona la variación de velocidad con el cambio de dirección.

Índice de Refracción (n)

El índice de refracción (n) de una solución es la relación que se establece entre la velocidad de la luz en el vacío ($c$) y la velocidad de la luz a su paso por esta solución ($v$).

• El valor del índice de refracción es directamente proporcional a la cantidad de sustancias disueltas en una solución y varía dependiendo de características como la concentración de dichas sustancias.
• Permite calcular la concentración de solutos en una solución midiendo su índice de refracción.

Aplicación Clínica

Los refractómetros clínicos son instrumentos que se utilizan en la refractometría de líquidos. Se basan en el fenómeno de la refracción de la luz para medir la concentración de sustancias disueltas en una solución acuosa, como la concentración de solutos (ej. albúmina) en muestras séricas o plasmáticas, y la medida del peso específico de la orina.