Fundamentos de la Cromatografía

La cromatografía engloba un conjunto de métodos analíticos utilizados para la separación de los componentes de una muestra, mediante su diferente distribución entre una fase fija y otra fase móvil.

La fase móvil o eluyente es un disolvente que engloba los componentes de la muestra (analitos) que se pretenden separar y los arrastra a lo largo de la fase fija. La fase fija o estacionaria es un producto que ejerce una retención en grado distinto sobre cada uno de los componentes de la muestra.

En la cromatografía, los diferentes componentes de la muestra son vehiculizados y arrastrados por el eluyente a lo largo de la fase estacionaria, que, al interactuar con cada uno de ellos, retiene más a unos que a otros. Por lo tanto, cada uno de los componentes progresa a lo largo de la fase estacionaria con una velocidad distinta, produciéndose una separación de los mismos.

Se conoce como poder de resolución de la técnica cromatográfica a la capacidad que tiene esta para separar los diversos componentes de la muestra sometida a estudio.

Podemos decir entonces que la cromatografía es un método de separación; sin embargo, mediante la incorporación de detectores e integradores a los aparatos que sirven para hacer algunos tipos de cromatografías (cromatógrafos), se puede mejorar la identificación de las sustancias separadas e, incluso, es posible su cuantificación.

Clasificación de los Tipos de Cromatografía

Según la naturaleza de las fases

• Si la fase móvil es un líquido, la cromatografía es líquida.
  • Si la fase fija es un sólido: Cromatografía Líquido-Sólido (LSC).
  • Si la fase fija es un líquido extendido sobre un soporte sólido: Cromatografía Líquido-Líquido (LLC).
• Si la fase móvil es un gas, la cromatografía es de gases.
  • Si la fase fija es un sólido: Cromatografía Gas-Sólido (GSC).
  • Si la fase fija es un líquido extendido sobre un soporte sólido: Cromatografía Gas-Líquido (GLC).

Según la forma en que está dispuesta la fase fija

• Cromatografía Plana: La fase fija es un papel de filtro o un sólido extendido, a modo de fina capa, sobre la superficie de un soporte en forma de lámina. En este último caso, se denomina Cromatografía en Capa Fina.
• Cromatografía en Columna: La fase fija está situada en el interior de un soporte en forma de columna.

Tipos de Cromatografía según el Mecanismo de Actuación

Cromatografía de Adsorción

Se basa en la interacción entre los analitos y un adsorbente, que es usado como fase fija. El adsorbente es un sólido poroso que posee grupos activos capaces de atraer y retener a los analitos en su superficie, mediante fuerzas electrostáticas, puentes de hidrógeno, etc. El adsorbente más frecuentemente utilizado es el gel de sílice (sílica-gel).

La cromatografía de adsorción puede ser líquido-sólido o gas-sólido. Puede realizarse en columna o en capa fina.

Cromatografía de Partición

Se basa en la separación de los analitos a consecuencia de su diferente distribución entre dos fases inmiscibles. La fase fija consiste en un líquido que se extiende uniformemente sobre la superficie de un soporte sólido constituido por partículas inertes.

Fase Normal y Fase Inversa

• Cromatografía de Fase Normal: Se utiliza como fase fija un líquido polar (como el etilénglicol) y la fase móvil es un líquido no polar (como el hexano). Los analitos más polares son retenidos con mayor fuerza.
• Cromatografía de Fase Inversa o Reversa: La fase fija es un líquido no polar (como el decano) y el eluyente es un líquido polar (como el agua). Cuanto mayor es la polaridad de los analitos, más rápidamente eluyen.

La cromatografía de partición suele ser de tipo líquido-líquido, pero también puede ser de tipo gas-líquido. Puede realizarse en capa fina o en columna.

Cromatografía de Intercambio Iónico

Este tipo de cromatografía se basa en la afinidad de iones en disolución por iones de carga eléctrica contraria (contraiones), que están presentes en la fase estacionaria. La principal fuerza de interacción es la electrostática.

La fase estacionaria consiste en unos grupos iónicos covalentemente unidos a un soporte sólido poroso, generalmente una resina. El eluyente suele ser una solución acuosa tamponada. Se produce una competición entre el analito y los iones de la fase móvil por su unión a los sitios iónicos de la fase fija.

Intercambio Aniónico y Catiónico

• Cromatografía de Intercambio Aniónico: Los grupos funcionales de la fase estacionaria son positivos (grupos catiónicos). Retiene aniones (analitos de carga eléctrica más negativa).
• Cromatografía de Intercambio Catiónico: Los grupos funcionales de la fase estacionaria son negativos (grupos aniónicos). Retiene cationes (analitos de carga eléctrica más positiva).

Las cromatografías de intercambio iónico son sólido-líquidas y normalmente se realizan en columna.

Cromatografía de Exclusión Molecular

La cromatografía de exclusión molecular, de filtración por gel o de penetrabilidad, se basa en la difusión selectiva de las moléculas de los analitos a través de los poros de la fase fija, debido al diferente tamaño molecular de cada una de ellas.

La fase estacionaria siempre es químicamente inerte. Si el eluyente es acuoso, la fase fija es un gel hidrófilo; si es orgánico, es un gel hidrófobo. El grado de retención depende del tamaño relativo de las moléculas respecto al tamaño de los poros de la fase fija.

Las moléculas grandes no penetran por los poros y salen primero. Las moléculas pequeñas penetran profundamente y son retenidas, eluyendo al final de la prueba.

Las cromatografías de exclusión molecular son líquido-sólido y normalmente se realizan en columna.

Cromatografía de Afinidad

Se utiliza para separar sustancias utilizando interacciones biológicas muy específicas, como las de enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo y hormona-receptor. La técnica requiere que el compuesto que se quiera separar se una reversiblemente a un ligando específico que se ancla a una matriz insoluble.

Para eluir la sustancia se cambia el pH, o se añade otro ligando por el que la fase estacionaria tenga mayor afinidad.

Las cromatografías de afinidad son líquido-sólido y se realizan en columna.

Técnicas Cromatográficas Específicas

Cromatografía en Capa Fina (TLC)

La cromatografía en capa fina se desarrolla sobre un soporte plano. Los mecanismos de separación más comunes son la adsorción (fase estacionaria sólida) y la partición (fase estacionaria líquida). Los adsorbentes más utilizados son la alúmina y el sílica-gel, y como soporte sólido, suelen emplearse láminas de aluminio, de vidrio o de plástico.

Procedimiento y Resultados

Si la muestra es un líquido complejo (por ejemplo, orina o suero) debe realizarse una extracción previa. El extracto se aplica sobre la capa fina. El eluyente asciende por capilaridad a lo largo de la capa fina y arrastra simultáneamente los analitos con diferente intensidad.

Los analitos separados se aprecian como manchas redondeadas (spots). Si no son coloreados, pueden observarse mediante un visor de fluorescencia o mediante la aplicación de reveladores (productos químicos capaces de producir un color, como el iodo).

Identificación y Cuantificación en TLC

• Identificación: Se calcula el Factor de Retención (Rf). El Rf de un analito es el cociente entre la distancia recorrida por el analito (detectado en forma de mancha) y la recorrida por el eluyente. Cada analito tiene su propio Rf, un valor característico. También se realiza mediante el sembrado de patrones al mismo tiempo que las muestras.
• Cuantificación: Se aplica patrones a distintas concentraciones y se compara el área de la mancha con la del analito. Métodos incluyen: medir su diámetro, raspar las manchas y pesar, raspar la mancha y valorar por espectrofotometría, o medir la dispersión de radiación mediante reflectometría.

La cromatografía en capa fina se emplea para separar e identificar multitud de analitos como drogas y aminoácidos (aa.).

Cromatografía en Columna Abierta

En este tipo de cromatografía, la fase fija se sitúa en el interior de un tubo de vidrio o de plástico. Puede ser una microcolumna. Los mecanismos más frecuentes son el intercambio iónico, la exclusión molecular y la afinidad.

La fase móvil es un líquido que es capaz de disolver la muestra, pero que no reacciona con los analitos. El procedimiento permite liberar los analitos que se fijan con menos fuerza y forzar la salida de los más retenidos mediante el vertido de otro eluyente con mayor capacidad de desplazamiento.

Si se agregan, sucesivamente, varios eluyentes con capacidad de desplazamiento progresivamente mayor, se puede obtener una serie de fracciones líquidas que contienen los analitos adecuadamente separados. Se puede acoplar un colector automático de fracciones. La cuantificación se determina por espectrofotometría VV-UV.

En el laboratorio de análisis clínicos, esta técnica se emplea para obtener y cuantificar la hemoglobina glicosilada y la hemoglobina A2, y como técnica de separación en la purificación de ácidos nucleicos.

Cromatografía sobre Columna Automatizada

En este tipo de técnicas, el eluyente, junto con los analitos, entra a presión a través de la columna, disminuyendo el tiempo de análisis. A la salida de la columna existe un detector que detecta cada componente eluído.

El Cromatograma

La respuesta gráfica adopta la forma de un pico más o menos Gaussiano y se denomina CROMATOGRAMA. La separación es tanto más eficaz cuanto más resueltos aparezcan los picos. Se ha de distinguir el inicio, el fin y el máximo.

Identificación y Cuantificación

• Identificación: Cada pico tiene su tiempo de retención. Este es el tiempo que tarda un analito en emerger de la columna. El tiempo de retención es el dato que contribuye a la identificación del analito, comparado con el obtenido con un patrón.
• Cuantificación: Se calcula el área de cada pico. El área será directamente proporcional a la concentración del analito. La concentración se calcula comparando el área del pico que le corresponde con el logrado al inyectar un patrón a una concentración conocida.

Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

La HPLC es un tipo especial de cromatografía en columna en la que la fase móvil es impulsada a lo largo de la columna a una presión muy alta. Permite la separación, además de su identificación y cuantificación.

Para evitar que las impurezas disminuyan la eficacia, se utilizan métodos de clean-up de la muestra: la filtración, la centrifugación, la precipitación, la extracción con disolventes o la purificación con cromatografías preparatorias.

Partes de un Cromatógrafo Líquido (HPLC)

1. Depósitos con Eluyente: La fase móvil suele ser una mezcla de dos componentes. El eluyente debe ser filtrado y desgasificado.
2. Bomba: Establece un flujo de eluyente a la presión necesaria. Proporciona un caudal constante. Puede ser de composición constante (isocrática) o de composición variable (con gradiente de elución).
3. Inyector: Permite la introducción de la muestra en la columna.
4. Columna: Es un cilindro de acero inoxidable. El relleno puede ser pelicular (bolas de vidrio cubiertas de fase estacionaria, como sílica gel) o de partícula porosa (en desuso). Si se liga químicamente un polímero de octadecilsilano a la superficie de la sílice, se genera una Fase Reversa.
5. Detector: Detecta la presencia de analitos a la salida de la columna. Los más habituales son:
   • Detectores de absorbancia ultravioleta visible (UV-VIS): El diode array permite medir la absorbancia simultáneamente a multitud de longitudes de onda.
   • Espectrómetros de masas: Dan información sobre la estructura molecular de los analitos.
6. Integrador-Registrador: Obtiene el cromatograma.

La HPLC se emplea en múltiples procesos analíticos clínicos (aminoácidos, hemoglobina glicosilada, catecolaminas) y en estudios toxicológicos.

Cromatografía de Gases (GC)

La cromatografía de gases es útil para la separación de analitos gaseosos o compuestos volátiles que no pierdan sus características físico-químicas al entrar en estado gaseoso.

Partes de un Cromatógrafo de Gases

1. Bombona con Gas Eluyente: La fase móvil es un gas inerte (gas portador), como el He o el N₂, que fluye de forma constante.
2. Inyector: La muestra se introduce en un recinto de inyección recalentado eléctricamente (a unos 350 °C), lo que volatiliza la solución que contiene el analito.
3. Columna: Son tubos capilares en cuyo interior se dispone la fase fija. La columna está introducida en un horno que evita que los analitos volátiles pasen a estado líquido.
4. Detector: Se emplean numerosos tipos de detectores, siendo el espectrómetro de masas uno de los más utilizados.

Electroforesis Capilar

Es una técnica analítica que sirve para separar las moléculas en relación con su carga eléctrica neta (la suma de las cargas positivas y negativas de sus grupos ionizables). En el curso pasado se pudo estudiar la electroforesis de zona.

Conceptos Clave

• Solución Tampón: Crea el pH adecuado a la separación y lo mantiene, garantizando que todas las moléculas conserven una carga eléctrica constante.
• Punto Isoeléctrico (pI): Es el valor de pH al cual el balance de cargas positivas y negativas superficiales de una sustancia es cero (carga neta nula). Al pH de su pI, una sustancia no migra.

Flujo Electrosmótico (Electroendósmosis)

Existe una fuerza que se opone a la movilidad electroforética: el flujo electrosmótico o electroendósmosis. Es una corriente de cationes hidratados hacia el cátodo, contraria al flujo de migración de los componentes de la muestra que se dirigen al ánodo (aniones).

Se produce por la adhesión de los cationes del tampón a radicales OH⁻ y COO⁻ que se encuentran en la superficie del soporte. Esta “contracorriente” arrastra a todas las moléculas presentes, independientemente de su carga.

La Electroforesis Capilar (CE)

El flujo electrosmótico es la clave de la Electroforesis Capilar. En lugar de una lámina o un gel, se utiliza un capilar hueco de sílica gel, que tiende a estar cargado negativamente. Presenta la ventaja de que se pueden utilizar altos voltajes, permitiendo separaciones rápidas ya que el calor generado se disipa fácilmente.

En esta técnica, las muestras se sitúan en el cátodo, y es el efecto electrosmótico el que las desplaza al ánodo, retrasando a los componentes de la muestra con carga negativa y favoreciendo a los de carga positiva. De esta manera se produce la separación.

Es de fácil automatización y pueden utilizarse detectores de todo tipo (fluorimétricos, espectrofotométricos, etc.) que realizan la medida directamente a través de la pared del capilar.