Digestión de ADN con Enzimas de Restricción

Para llevar a cabo una digestión de ADN se necesita:

• ADN (por ejemplo, genómico)
• Enzima de restricción (como EcoRI)
• Tampón de reacción (específico para cada enzima, normalmente concentrado 10X)
• Agua ultrapura (para ajustar la concentración del tampón a 1X)
• BSA (opcional): estabiliza y mejora la actividad de la enzima.

La mezcla se incuba a la temperatura óptima de la enzima (normalmente 37 °C, aunque algunas requieren otras como 65 °C). El tiempo de incubación varía según la enzima y la cantidad de ADN (de 15 minutos a varias horas). En casos de digestión doble, se usan dos enzimas compatibles en la misma reacción, asegurando que compartan la misma temperatura y tampón.

Usos Principales de las Enzimas de Restricción

1. Clonación de ADN:

   Se utilizan para cortar el ADN en fragmentos que luego pueden insertarse en vectores de clonación como plásmidos.

2. Detección de Mutaciones o Polimorfismos:

   Después de la digestión, los patrones observados mediante electroforesis en gel permiten determinar los alelos en función de que se produzca un corte del fragmento o que no se produzca.

3. Preparación de Genotecas o Librerías para Secuenciación:

   Cortan el ADN en fragmentos que luego son secuenciados mediante metodologías de secuenciación genómica masiva.

Cálculo de Unidades de Enzima para Digestión de ADN

Si tienes 10 µg de ADN genómico y quieres digerirlo con una enzima de restricción cuya actividad es 10 U/µg de ADN, ¿cuántas unidades de enzima necesitas para asegurar una digestión completa? ¿Qué volumen de enzima necesitas si tiene una concentración de 2000 U/µL?

Unidades (U) necesarias = Cantidad de ADN × Unidades (U) de enzima por μg de ADN
Unidades (U) necesarias = 10 μg × 10 U/μg = 100 U de enzima

Volumen de enzima = Unidades (U) necesarias / Concentración de enzima
Volumen de enzima = 100 U / 2000 U/µL = 0,05 µL de enzima

Clonación Molecular: Obtención y Replicación de ADN Recombinante

La clonación molecular es una técnica que permite obtener muchas copias de un fragmento específico de ADN. Para ello, se construye una molécula de ADN recombinante combinando el fragmento deseado con un vector de clonación, que luego se introduce en bacterias, donde se replica.

1. Obtención del ADN de Interés

   El fragmento de ADN que se quiere clonar puede obtenerse por diferentes métodos, como una reacción de PCR, una digestión de ADN genómico con enzimas de restricción, síntesis química, o combinaciones de fragmentos (por ejemplo, un gen junto con su promotor). Este fragmento debe estar preparado para insertarse en el vector.

2. Preparación del Vector de Clonación

   Los vectores más comunes son los plásmidos, aunque también se pueden usar fagos, cósmidos o cromosomas artificiales. El vector se abre con la misma enzima de restricción que se usó para el ADN de interés, de forma que sus extremos sean compatibles. Algunos vectores como el pGEM-T ya están preparados para aceptar fragmentos de PCR sin necesidad de digestión, facilitando el proceso.

3. Formación del ADN Recombinante

   Una vez se tienen el vector y el fragmento preparados, se mezclan en una reacción de ligación con ADN ligasa, que une ambos fragmentos formando una molécula de ADN recombinante, circular y de doble cadena.

4. Transformación Bacteriana

   El ADN recombinante se introduce en bacterias competentes (por ejemplo, E. coli) usando un protocolo con CaCl₂ y choque térmico. El Ca²⁺ facilita la entrada del ADN al neutralizar cargas negativas y el calor crea poros temporales en la membrana por donde entra el plásmido.

5. Selección de Clones Transformados

   Las bacterias se siembran en un medio con antibiótico. Solo crecerán las que hayan incorporado el plásmido, ya que contiene un gen de resistencia. Cada colonia que aparece proviene de una célula transformada, y se considera un clon. A veces se usa además un gen reportero (como lacZ o GFP).

6. Amplificación y Caracterización

   Una vez seleccionadas las colonias correctas, se cultivan en medio líquido para multiplicar el ADN recombinante. Luego se puede extraer mediante técnicas como minipreps, digerirlo con enzimas para comprobar su contenido, o incluso secuenciarlo. También puede usarse para producir proteínas si el plásmido está diseñado para expresión.

Ejemplo de Amplificación por PCR

Amplificación del gen DFR:

• Cebadores: DFR-F, DFR-R y DFR-Y.
• Componentes: ADN, cebadores, Blue Taq mix.
• Resultados:
  • Rojas: amplificación con DFR-F y DFR-R, tamaño amplificado a 1900 pb.
  • Amarillas: amplificación con DFR-F y DFR-Y, tamaño amplificado 159 pb.
  • Blancas: no amplifican.

Amplificación del gen ASN:

• Cebadores: ASN-F y ASN-R.
• Componentes: ADN, cebadores, Blue Taq mix.
• Resultados:
  • Rojas: tamaño amplificado a 428 pb.
  • Rosas: tamaño amplificado a 818 pb.

Componentes Clave de un Plásmido de Clonación

1. Origen de Replicación:

   Es una secuencia específica de ADN que permite al plásmido (o ADN recombinante) replicarse de manera autónoma dentro de la célula hospedadora. Proporciona un punto de inicio para la maquinaria de replicación de ADN de la bacteria.

2. Sitio de Clonación Múltiple (MCS) o Polylinker:

   Es una región del plásmido que contiene múltiples sitios de reconocimiento para enzimas de restricción y facilita la inserción mediante ligación del ADN de interés.

3. Gen de Resistencia a Antibiótico:

   Es una región del plásmido que codifica un gen de resistencia a un antibiótico (ej. ampicilina, kanamicina). De este modo, las bacterias son resistentes a dicho antibiótico.

4. Promotor:

   Los promotores (ej. promotor T7) permiten la transcripción del ADN insertado y son importantes en plásmidos diseñados para la expresión génica. Estos promotores son inducibles y permiten la expresión de proteínas.

5. Gen Chivato o Gen Reportero:

   Permite monitorear la funcionalidad del vector (ej. expresión del gen GFP de la proteína verde fluorescente) o detectar la inserción del ADN de interés en el vector (ej. gen lacZ del operón lactosa, selección de colonias blancas/azules).

6. Secuencias de Unión para Secuenciación:

   Son secuencias de ADN reconocidas por los cebadores universales M13 directo y M13 reverso que permiten la secuenciación del ADN de interés insertado en el plásmido.

Técnica de Miniprep: Aislamiento de ADN Plasmídico

La técnica de miniprep permite aislar ADN plasmídico (o recombinante) de cultivos bacterianos, separándolo del ADN cromosómico y otros componentes celulares mediante resuspensión, lisis, neutralización y purificación.

Pasos Principales:

1. Resuspensión: Se recogen las bacterias del cultivo y se resuspenden con un tampón que protege el ADN plasmídico.
2. Lisis Celular y Desnaturalización: Se añade SDS y NaOH para romper las membranas, liberar el ADN y desnaturalizarlo.
3. Neutralización: Se usa acetato potásico para neutralizar la mezcla. El ADN plasmídico renaturaliza y permanece en solución; el ADN cromosómico y proteínas precipitan.
4. Purificación del ADN Plasmídico: Se purifica el ADN del sobrenadante mediante precipitación con etanol o usando un kit comercial con columnas de sílice.
5. Elución o Rehidratación: Finalmente, el ADN se rehidrata o se eluye con agua ultrapura o tampón TE, quedando listo para su análisis o uso posterior.

BLAST: Herramienta Bioinformática para Comparación de Secuencias

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) es una herramienta bioinformática utilizada para encontrar similitudes entre secuencias de ADN, ARN o proteínas. Permite a los usuarios comparar una secuencia de interés («query») con bases de datos biológicas y determinar relaciones evolutivas, funcionales y estructurales entre secuencias. El sitio principal para realizar búsquedas BLAST es el NCBI (National Center for Biotechnology Information), que proporciona acceso a diversas bases de datos genómicas y proteicas.

Tipos de Búsquedas BLAST:

• BLASTn: Comparación de secuencias de ADN.
• BLASTp: Comparación de secuencias de proteínas.
• BLASTx: Traducción de una secuencia de ADN en sus posibles proteínas y comparación con bases de datos de proteínas.
• tBLASTn: Comparación de una proteína con bases de datos de secuencias de ADN traducidas.
• tBLASTx: Comparación de secuencias de ADN traducidas con otras secuencias de ADN traducidas.

Parámetros de Búsqueda:

1. Query Sequence: Introducir la secuencia de ADN, ARN o proteína (en formato FASTA o directamente).
2. Database: Seleccionar la base de datos a comparar. Ejemplos:
   • nt: Bases de datos de nucleótidos.
   • nr: Bases de datos de proteínas.
3. Program Selection: Elegir el algoritmo más adecuado (opciones avanzadas).
4. Otros Parámetros: Se pueden ajustar criterios como el organismo objetivo o el modelo evolutivo.

Resultados de BLAST:

1. Tabla de Coincidencias: Lista las secuencias en la base de datos que coinciden con tu query.
   • Score: Indica la calidad del alineamiento.
   • E-value: Probabilidad de encontrar una coincidencia por azar (valores más bajos son mejores).
   • Identidad (%): Indica el porcentaje de coincidencia entre secuencias.
2. Alineamientos: Visualiza el alineamiento entre la secuencia query y las coincidencias. Se resaltan las regiones coincidentes y las discrepancias.
3. Vista Gráfica: Muestra una representación visual del alineamiento, con colores que indican la fuerza de la coincidencia.

Aplicaciones de BLAST:

1. Identificación de Genes: Encontrar genes homólogos en otros organismos.
2. Análisis Evolutivo: Comparar secuencias para construir filogenias.
3. Predicción Funcional: Identificar genes o proteínas con funciones similares.
4. Anotación de Genomas: Ayudar en la identificación y clasificación de secuencias.

Identificación de Proteínas por Espectrometría de Masas

A) Identificación por Masa Molecular (ESI-MS):

ESI (Electrospray Ionization) evapora las proteínas (que se encuentran en un medio líquido) a fase gaseosa y estas adquieren una o más cargas positivas por la adición de protones (H⁺), es decir, se ionizan. Una vez ionizadas, pueden dar señal en el espectrofotómetro de masas. Una vez están ionizadas, pasan por un tubo analizador de masas con voltaje, haciendo que las proteínas se ordenen según una magnitud masa/carga (m/z). No se ordenan por su masa, sino por su relación masa/carga. Este método genera iones multiprotonados.

B) Identificación por Huella Peptídica (MALDI-TOF):

Consiste en la separación de la proteína por electroforesis mono o bidimensional. La proteína se digiere mediante la proteasa tripsina (digestión enzimática), que corta por el extremo carboxilo de Lisina (K) y Arginina (R), generando péptidos trípticos. MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) pasa los péptidos (en un medio sólido) por un láser para ionizarlos. En vez de multiprotonarlos como en ESI, salen monoprotonados (la m/z equivale al valor de m, ya que z=1). La masa molecular de un péptido tríptico se llama huella peptídica.

C) Secuenciación de Péptidos mediante Espectrometría de Masas en Tándem (MS-MS):

A partir de los péptidos trípticos monoprotonados de MALDI, estos pasan por el primer analizador, llamado celda de colisión, donde hay un gas noble (por ejemplo, argón) para que los péptidos colisionen y fragmenten. Los fragmentos pasan por un segundo analizador donde se ordenan de forma m/z. Cuando los péptidos se fragmentan en dos, uno será neutro (no detectable por MS) y el otro tendrá carga. Si la carga está en el fragmento con el residuo N-terminal se marca como ‘b’, si está en el C-terminal se marca como ‘y’.

Práctica 2: Cromatografía de Intercambio Iónico y Ensayo Enzimático

En una cromatografía en columna, donde tenemos una fase estacionaria y otra móvil, las proteínas con un punto isoeléctrico (pI) menor de 6 se quedan retenidas en la columna. Las proteínas con un pI mayor que 6 eluirán de la columna. La carga neta de una proteína será 0 cuando el pH del medio sea igual a su pI, donde se compensarán las cargas.

DEAE: Intercambiador Aniónico

La beta-D-galactosidasa es una enzima hidrolasa que cataliza la hidrólisis de oligosacáridos, polisacáridos y glicoconjugados, así como sustratos sintéticos con D-galactosa unida por enlace beta-glicosídico. Para medir su actividad, se utiliza el sustrato p-nitrofenil-beta-D-galactopiranósido, cuya hidrólisis produce D-galactosa y p-nitrofenol. Este último es incoloro en pH ácido y se vuelve amarillo en pH neutro o básico, permitiendo su cuantificación en un espectrofotómetro. La variación en la concentración de p-nitrofenol en el tiempo permite calcular la actividad enzimática. La adición de Na₂CO₃ eleva el pH a valores muy básicos con lo que se consigue:

1. Detener la reacción, ya que las enzimas se inactivan.
2. Permitir el desarrollo del color amarillo del p-nitrofenol que puede ser detectado por espectrofotometría a 400 nm; la intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de p-nitrofenol liberado.

Aspartilglutamillisilarginilhistidina (DEKRH). Este pentapéptido tiene un grupo alfa-amino libre, un grupo alfa-carboxilo libre y cinco grupos R ácidos o básicos ionizables. Los grupos ionizados a pH 7,0 se muestran en color rojo.

Práctica 3: Cromatografía de Afinidad y Ensayo de GST

En una cromatografía de afinidad, un ligando es inmovilizado químicamente en la fase estacionaria. En este caso, el ligando es el glutatión, que se une de manera específica a la GST (enzima), y a su vez esta está inmovilizada sobre agarosa. Las demás proteínas del extracto, al no estar unidas específicamente, se descartan con facilidad, y la GST, al no ser una unión covalente, se separa con una dilución de mayor concentración de sal o glutatión libre.

La glutatión S-transferasa (EC 2.5.1.18) es una enzima que cataliza la conjugación del glutatión reducido con compuestos hidrofóbicos que contienen un centro electrofílico, protegiendo contra xenobióticos y moléculas reactivas generadas por reacciones oxidativas celulares. En el ensayo de valoración, la enzima cataliza la conjugación del 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) con el glutatión, formando un conjugado que absorbe intensamente a 340 nm, lo que permite medir la actividad enzimática.

Características de las Glutatión S-Transferasas (GST):

• Son una familia de enzimas metabólicas de procariotas y eucariotas.
• Catalizan la conjugación del glutatión reducido (GSH) con sustratos electrofílicos.
• Están implicadas en procesos de eliminación de compuestos xenobióticos* con fines de desintoxicación.
• Las GST se dividen en tres superfamilias proteicas: citosólicas, mitocondriales y microsomales.

*Xenobióticos: Sustancias químicas extrañas al organismo.

Cuantificación de Proteínas con Azul Coomassie:

El Azul Coomassie, un derivado del trifenilmetano, se utiliza para estimar la concentración de proteínas en disolución. El coeficiente de extinción de una solución de complejo colorante-albúmina es constante en un intervalo de concentración amplio. La ley de Beer puede aplicarse para cuantificar con precisión las proteínas, seleccionando una relación adecuada entre el volumen de colorante y la concentración de la muestra.

Práctica 4: Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)

Gel de Apilamiento (Stacking Gel):

Ubicado en la parte superior, tiene un pH de 6,8, cercano al pI de la glicina. La glicina, junto con los iones cloruro (Cl⁻), crea un efecto «sándwich» que concentra las proteínas en una banda estrecha. Este proceso se conoce como isotacoforesis, donde la movilidad de las proteínas está determinada por su carga neta, lo que provoca que todas se muevan a una velocidad similar, apilándose.

Gel Separador (Resolving Gel):

Ubicado en la parte inferior, tiene un pH de 8,8, lo que aleja a la glicina de su pI, permitiendo que migre por delante de las proteínas. En este gel, las proteínas se separan principalmente por tamaño debido a la resistencia de la matriz del gel. En cuanto a los compuestos utilizados, el TEMED cataliza la formación de radicales libres para la polimerización de la acrilamida. El tampón de carga 2X es fundamental para preparar las proteínas antes de la electroforesis, desnaturalizándolas (generalmente a 95-100°C) y linealizando su estructura.

Polimerización y Reticulación de la Acrilamida:

La proporción de bisacrilamida (N,N’-metilenbisacrilamida) y acrilamida, así como la concentración total de ambos componentes, afectan al tamaño de los poros y a la rigidez final de la matriz de gel. Estos, a su vez, afectan a la gama de tamaños de proteínas (pesos moleculares) que pueden resolverse.

Tampón de Muestra: Componentes Clave

El tampón de muestra en SDS-PAGE contiene componentes esenciales como el beta-mercaptoetanol (BME) y el dodecilsulfato sódico (SDS). El BME es un agente reductor que rompe los puentes disulfuro, tanto intermoleculares como intramoleculares, formados por los residuos de cisteína en las proteínas.

Sistema Discontinuo de Geles:

En el sistema discontinuo, la glicina cambia su estado de carga dependiendo del pH del gel. En el gel de apilamiento (pH ~6,8), la glicina es neutra o ligeramente negativa, lo que permite que los iones cloruro del Tris-HCl migren más rápido, generando un gradiente de voltaje que concentra las proteínas en una banda definida. Al entrar en el gel de separación (pH ~8.8), la glicina se vuelve completamente negativa y migra por delante de las proteínas, permitiendo su separación por tamaño.

Fórmulas Relevantes en Bioquímica:

• n = (m1 - 1) / (m2 - m1)
• M = n * (m2 - 1)
• c = a / (e * l) (Ley de Beer-Lambert: concentración = absorbancia / (coeficiente de extinción * longitud de paso))
• aenz = c / (ml * min) (Actividad enzimática)
• Rf = banda / frente (Factor de retardo en cromatografía/electroforesis)
• log Mr = 10^(ecuacion y=aRf+b) (Cálculo de peso molecular a partir de Rf)
• y = abs (Absorbancia)
• En valoraciones y = ax + z
• i = abs

Componentes Químicos y sus Funciones en SDS-PAGE:

Estructuras Químicas:

• Glicina: H₂N – CH₂ – COOH
• Beta-Mercaptoetanol: HS – CH₂ – CH₂ – OH
• Acrilamida: CH₂ = CH – CO – NH₂
• Dodecilsulfato sódico (SDS): CH₃ – (CH₂)₁₁ – OSO₃⁻ Na⁺

Funciones de los Reactivos:

• SDS: Confiere carga negativa a las proteínas y las desnaturaliza.
• Beta-Mercaptoetanol: Separa las subunidades proteicas y rompe puentes disulfuro.
• Coomassie: Tiñe las proteínas para su visualización.
• TEMED: Cataliza la polimerización de acrilamida y bisacrilamida.